某些物質的分子吸收一定能量後，電子從基態躍遷到激發態，以光輻射的形式從激發態回到基態，這種現象稱為分子發光，在此基礎上建立起來的分析方法為分子發光分析法。
基本介紹
- 中文名：分子發光分析法
- 外文名：Molecular luminescence analysis
- 類別：分析方法
- 用途：分析分子發光現象
化學發光分析,釋義,特點,基本原理,螢光和磷光,激發過程,發射過程,反應的類型,氣相化學發光,液相化學發光,激發發射光譜,激發光譜,發射光譜,測量儀器,分離取樣式,流動注射式,影響因素,
化學發光分析
釋義
化學發光（Chemiluminescence）又稱為冷光（Cold Light），它是在沒有任何光、熱或電場等激發的情況下，由化學反應而產生的光輻射。生命系統中也有化學發光，稱生物發光（Bioluminescence），如螢火蟲、某些細菌或真菌、原生動物、蠕蟲以及甲殼動物等所發射的光。化學發光分析（Chemiluminescence Analysis）就是利用化學反應所產生的發光現象進行分析的方法。它是近30多年來發展起來的一種新型、高靈敏度的痕量分析方法。在痕量分析、環境科學、生命科學及臨床醫學上得到愈來愈廣泛的套用。
特點
極高的靈敏度
較好的選擇性
由於可以利用的化學發光反應較少，而且化學發光的光譜是由受激分子或原子決定的，一般來說也是由化學反應決定的。很少有不同的化學反應產生出同一種發光物質的情況，因此化學發光分析具有較好的選擇性。
儀器裝置簡單
不需要複雜的分光和光強度測量裝置，一般只需要干涉濾光片和光電倍增管即可進行光強度的測量。
分析速度快
一次分析在1 min之內就可完成，適宜自動連續測定。
定量線性範圍寬
化學發光反應的發光強度和反應物的濃度在幾個數量級的範圍內成良好的線性關係。
基本原理
化學發光是基於化學反應所提供足夠的能量，使其中一種產物的分子的電子被激發成激發態分子，當其返回基態時發射一定波長的光，稱為化學發光，表示如下
A + B → C﹡ + D
C﹡→ C + hυ
化學發光包括吸收化學能和發光兩個過程。為此，它應具備下述條件：
1化學發光反應必須能提供足夠的化學能，以引起電子激發。
2要有有利的化學反應歷程，以使所產生的化學能用於不斷地產生激發態分子。
3激發態分子能以輻射躍遷的方式返回基態，而不是以熱的形式消耗能量。
化學發光反應的化學發光效率ΦCl，取決於生成激發態產物分子的化學激發效率Φr利激發態分子的發光效率Φf這兩個因素。化學發光的發光強度ICl以單位時間內發射的光子數來表示，它等於化學發光效率ΦCl與單位時間內起反應的被測物濃度CA的變化（以微分表示）的乘積，通常，在發光分析中，被分析物的濃度與發光試劑相比，要小很多，故發光試劑濃度可認為是一常數，因此發光反應可視為是—級動力學反應，此時反應速率可表示為式中k為反應速率常數。由此可得：在合適的條件下，t時刻的化學發光強度與該時刻的分析物濃度成正比，可以用於定量分析，也可以利用總發光強度S與被分析濃度的關係進行定量分析，此時，將式（5-7）積分，得到如果取t1=0，t2為反應結束時的時間，則得到整個反應產生的總發光強度與分析物的濃度呈線性關係。
螢光和磷光
激發過程
螢光和磷光的產生涉及光子的吸收和再發射兩個過程。
分子吸收輻射使電子能級從基態躍遷到激發態能級，同時伴隨著振動能級和轉動能級的躍遷。在分子能級躍遷的過程中，電子的自旋狀態也可能發生改變。套用於分析化學中的螢光和磷光物質幾乎都含有π→π*躍遷的吸收過程，它們部含有偶數電子。根據泡里不相容原理，在同一軌道上的兩個電子的自旋方向要彼此相反，即基態分子的電子是自旋成對的，淨自旋為零，這種電子都配對的分子電子能態稱為單重態（singlet state），具有抗磁性。當分子吸收能量後，在躍遷過程中不發生電子自旋方向的變化，這時分子處於激發的單重態；如果在躍遷過程中還伴隨著電子自旋方向的改變，這時分子便有兩個自旋不配對的電子，分子處於激發三重態（triplet state），具有順磁性。
發射過程
處於激發態的分子是不穩定的，通常以輻射躍遷或無輻射躍遷方式返回到基態，這就是激發態分子的失活（deactivation）。輻射躍遷的去活化過程，發生光子的發射，即產生螢光和磷光；無輻射躍遷的去活化過程則是以熱的形式失去其多餘的能量，它包括振動弛豫、內轉換、系間跨越及外轉換等過程。如圖3-2所示，S0、S1、S2分別表示分子的基態、第一和第二激發單重態；T1，T2分別表示第一和第二激發三重態。
（1）振動弛豫（Vibration Relaxation，VR）。即由於分子間的碰撞，振動激發態分子由同一電子能級中的較高振動能級轉移至較低振動能級的無輻射躍遷過程。發生振動弛豫的時間約為10-12 s數量級。
（2）內轉換（Internal Conversion，IC）。指在相同多重態的兩個電子能級間，電子由高能級轉移至低能級的無輻射躍遷過程。當兩個電子能級非常靠近以致其能級有重疊時，內轉換很容易發生。兩個激發單重態或兩個激發三重態之間能量差較小，並且它們的振動能級有重疊，顯然這兩種能態之間易發生內轉換。
（3）螢光發射。激發態分子經過振動馳豫降到激發單重態的最低振動能級後，如果是以發射光量子躍遷到基態的各個不同振動能級，又經振動馳豫回到最低基態時就發射螢光。從螢光發射過程明顯地看到：螢光是從激發單重態的最低振動能級開始發射，與分子被激發至哪一個能級無關；螢光發射前後都有振動馳豫過程。因此螢光發射的能量比分子所吸收的輻射能量低，所以對於溶液中分子的螢光光譜的波長與它的吸收光譜波長比較，螢光的波長要長一些（Stock位移）。
（4）系間跨越（Intersystem Crossing，ISC）是指不同多重態間的無輻射躍遷，同時伴隨著受激電子自旋狀念的改變，如S1→T1。在含有重原子（如溴或碘）的分子中，系間跨越最常見。這是因為在原子序數較高的原子中，電子的自旋和軌道運動間的相互作用變大，原子核附近產生了強的磁場，有利於電子自旋的改變。所以含重原子的化合物的螢光很弱或不能發生螢光。
（5）外轉換（External Conversion，EC）是指激發分子通過與溶劑或其他溶質分子間的相互作用使能量轉換，而使螢光或磷光強度減弱甚至消失的過程。這一現象又稱為“熄滅”或“猝滅”。
（6）磷光發射。第一激發單重態的分子，有可能通過系間跨越到達第一電子激發三重態，再通過振動馳豫轉至該激發三重態的最低振動能級，再以無輻射形式失去能量躍遷回基態而發射磷光。激發三重態的平均壽命為10-4～10 s，因此，磷光在光照停止後仍可維持一段時間。
反應的類型
氣相化學發光
主要有O3，NO和SO2，S，CO的化學發光反應，套用於檢測空氣中的O3，NO，NO2，H2S，SO2和CO2等。
火焰化學發光也屬於氣相化學發光範疇。在300～400 ℃的火焰中，熱輻射是很小的，某些物質可以從火焰的化學反應中吸收化學能而被激發，從而產生火焰化學發光。火焰化學發光現象多用於硫、磷、氮和鹵素的測定。
液相化學發光
液相化學發光反應在痕量分析中十分重要。常用於化學發光分析的發光物質有魯米諾、光澤精、洛粉鹼、沒食子酸、過氧草酸鹽等，其中魯米諾是最常用的發光試劑，其化學名稱為3-氨基苯二甲醯酸肼，在鹼性水溶液、二甲基亞碸或二甲基甲醯胺等極性有機溶劑中能被某些氧化劑氧化，產生最大輻射波長為425 nm（水溶液）或485 nm（二甲基亞碸溶液）的光，化學發光效率為0.01～0.05。
魯米諾被H2O2氧化的反應速度很慢，但許多金屬離子在適當的反應條件下能增大這一發光反應的速度，在一定的濃度範圍內，發光強度與金屬離子濃度呈良好的線性關係，故可用於痕量金屬離子的測定.這些方法的靈敏度都非常高，但由於至少有約30種金屬離子回催化或抑制該反應，使方法的選擇性不好，限制了在實際工作中的套用。
魯米諾及其衍生物的發光反應還可以套用於有機物、藥物、生物體液中的低含量激素、新陳代謝物的測定（表3-3）。例如機體中的超氧陰離子·O2-，能直接與魯米諾作用產生化學發光而被檢測，靈敏度高，儀器設備簡單，便於推廣。機體中的超氧化物歧化酶（SOD）能促使·O2-歧化為O2和H2O2，故SOD對·O2-有清除作用，由於SOD的存在，使魯米諾-·O2-體系的化學發光受到抑制，可間接測定SOD。
激發發射光譜
激發光譜
螢光和磷光均為光致發光現象，所以必須選擇合適的激發光波長。激發光譜的測繪方法為：固定螢光的最大發射波長，然後改變激發光的波長。根據所測得的螢光（或磷光）強度與激發光波長的關係作圖，得到激發光譜曲線，見圖3-3A。激發光譜曲線上的最大螢光（或磷光）強度所對應的波長，稱為最大激發波長，用λex表示。它表示在此波長處，分子吸收的能量最大，處於激發態分子的數目最多，因而能產生最強的螢光。
發射光譜
又稱螢光（或磷光）光譜。選擇最大激發波長作為激發光波長，然後測定不同發射波長時所發射的螢光或磷光強度，得到螢光或磷光光譜曲線，見圖3-3F、P。其最大螢光或磷光強度處所對應的波長稱為最大發射波長，用λem表示。
溶液螢光光譜通常有以下幾個特徵：
1）Stokes位移。在溶液螢光光譜中，所觀察到的螢光的波長總是大於激發光的波長，即λem>λex。這主要是由於發射螢光之前的振動馳豫和內轉換過程損失了一定的能量，這是產生Stokes位移的主要原因。
2）螢光發射光譜的形狀與激發波長無關。由於螢光發射發生於第一電子激發態的最低振動能級，而與螢光體被激發至哪一個電子態無關，所以螢光光譜的形狀通常與激發波長無關。
3）與激發光譜大致成鏡像對稱關係。一般情況下，基態和第一電子激發單重態中振動能級的分布情況是相似的，所以螢光光譜同激發光譜的第一譜帶大致成鏡像對稱。
測量儀器
在液相化學發光分析中，當試樣與有關試劑混合後，化學發光反應立即發生，且發光信號瞬間即消失。因此，如果不在混合過程中立即測定，就會造成光信號的損失。由於化學發光反應的這一特點，樣品與試劑混合方式的重複性就成為影響分析結果精密度的主要因素。按照進樣方式，可將發光分析儀分為分離取樣式和流動注射式兩類。
分離取樣式
分離式化學發光儀是一種在靜態下測量化學發光信號的裝置。它利用移液管或注射器將試劑與樣品加入反應室中，靠攪動或注射時的衝擊作用使其混合均勻，然後根據發光峰面積的積分值或峰高進行定量測定。
化學發光儀
化學發光儀分離取樣式儀器具有設備簡單、造價低、體積小和靈敏等優點，還可記錄化學發光反應的全過程，故特別適用於反應動力學研究。但這類儀器存在兩個嚴重缺點：一是手工加樣速度較慢，不利於分析過程的自動化，且每次測試完畢後，要排除池中廢液並仔細清洗反應池，否則產生記憶效應；另一點是加樣的重複性不好控制，從而影響測試結果的精密度。
流動注射式
流動注射式是流動注射分析在化學發光分析中的一個套用。光度法、化學發光法、原子吸收光度法和電化學法的許多間隙操作式的方法，都可以在流動注射分析中得到快速、準確而自動地進行。流動注射分析是基於把一定體積的液體試樣注射到一個運動著的、無空氣間隔的、由適當液體組成的連續載流中，被注入的試樣形成一個帶，然後被載流帶到檢測器中，再連續地記錄其光強、吸光度、電極電位等物理參數。在化學發光分析中，被檢測的光信號只是整個發光動力學曲線的一部分，以峰高來進行定量分析。
在發光分析中，要根據不同的反應速度，選擇試樣準確進到檢測器的時間，以使發光峰值的出現時間與混合組分進入檢測器的時間恰好吻合。用流動注射式進行化學發光分析，得到了比分離式發光分析法更高的靈敏度與更好的精密度。
影響因素
螢光量子產率又稱螢光效率，物質分子吸收輻射後，能否發生螢光取決於分子的結構。螢光強度的大小不但與物質的分子結構有關，也與環境因素有關。 它表示物質發射螢光的能力，Φ越大，發射的螢光越強。由前面已經提到的螢光產生的過程中可以明顯地看出，物質分子的螢光產率必然由激發態分子之活化過程的各個相對速率決定。若用數學式來表達這些關係，得到式中：kf為螢光發射的速率常數，∑ki為其他無輻射躍遷速率常數的總和。顯然，凡是能使kf升高而其他ki值降低的因素都可使螢光增強；反之，螢光就減弱。kf的大小主要取決於化學結構；其他ki值則強烈地受環境的影響，也輕微地受化學結構的影響。
螢光與分子結構
（1） 躍遷類型。實驗證明，π→π*躍遷是產生螢光的主要躍遷類型，所以絕大多數能產生螢光的物質都含有芳香環或雜環。
（2） 共軛效應。增加體系的共軛度，螢光效率一般也將增大，並使螢光波長向長波方向移動。共軛效應使螢光增強的原因，主要是由於增大螢光物質的摩爾吸光係數，π電子更容易被激發，產生更多的激發態分子，使螢光增強。
（3） 剛性平面結構。螢光效率高的物質，其分子多是平面構型，且具有一定的剛性。例如螢光素和酚酞結構十分相似，螢光素呈平面構型，是強螢光物質，而酚酞沒有氧橋，其分於不易保持平面，不是螢光物質。又如芴和聯苯，芴在強鹼溶液中的螢光效率接近1，而聯苯僅為0.20，這主要是由於芴中引入亞甲基，使芴剛性增強的緣故。再有萘和維生素A都有5個共軛雙鍵，萘是平面剛性結構，維生素A為非剛性結構，因而萘的螢光強度是維生素A的5倍。
一般說來，分子結構剛性增強，共平面性增加，螢光增強。這主要是由於增加了π電子的共軛度，同時減少了分子的內轉換和系間跨越過程以及分子內部的振動等非輻射躍遷的能量損失，增強了螢光效率。
（4） 取代基效應。芳烴和雜環化合物的螢光光譜和螢光強度常隨取代基而改變。表3-1列出了部分基團對苯的螢光效率和螢光波長的影響。一般說來，給電子取代基如-OH，-NH2，-OR，-NR2等能增強螢光；這是由於產生了p-π共軛作用，增強了π電子的共軛程度，導致螢光增強，螢光波長紅移。而吸電子取代基如-NO2，-COOH，-C=O，鹵素離子等使螢光減弱。這類取代基也都含有π電子，然而其π電子的電子云不與芳環上π電子共平面，不能擴大π電子共軛程度，反而使S1→T1系間跨越增強，導致螢光減弱，磷光增強。例如苯胺和苯酚的螢光較苯強，而硝基苯則為非螢光物質。鹵素取代基隨鹵素相對原子質量的增加，其螢光效率下降，磷光增強。這是由於在鹵素重原子中能級交叉現象比較嚴重，使分子中電子自旋軌道耦合作用加強，使S1→T1系間跨越明顯增強的緣故，稱為重原子效應。
環境影響
（1）溶劑的影響。一般地講，許多共軛芳香族化合物的螢光強度隨溶劑極性的增加而增強，且發射峰向長波方向移動。如圖3-4所示，8-羥基喹啉在四氯化碳、氯仿、丙酮和乙腈四種不同極性溶劑中的螢光光譜。這是由於n→π*躍遷的能量在極性溶劑中增大，而π→π*躍遷的能量降低，從而導致螢光增強，螢光峰紅移。在含有重原子的溶劑如碘乙烷和四氯化碳中，與將這些成分引入螢光物質中所產生的效應相似，導致螢光減弱，磷光增強。
（2）溫度的影響。溫度對於溶液的螢光強度有著顯著的影響。通常，隨著溫度的降低，螢光物質溶液的螢光量子產率和螢光強度將增大。如螢光索鈉的乙醇溶液，在0℃以下溫度每降低10℃，螢光量子產率約增加3%，冷卻至-80℃時，螢光量子產率接近100%。
（3）pH的影響。假如螢光物質是一種弱酸或弱鹼，溶液的pH值改變將對螢光強度產生很大的影響。大多數含有酸性或鹼性基團的芳香族化合物的螢光光譜，對於溶劑的pH和氫鍵能力是非常敏感的。表3-1中苯酚和苯胺的數據也說明了這種效應。其主要原因是體系的pH值變化影響了螢光基團的電荷狀態。當pH改變時，配位比也可能改變，從而影響金屬離子-有機配位體螢光配合物的螢光發射。因此，在螢光分析中要注意控制溶液的pH。
（4）螢光的熄滅。它是指螢光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用引起螢光強度降低的現象。這些引起螢光強度降低的物質稱為熄滅劑。
