《人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ檢測方法》是中國醫學科學院輸血研究所和貴州泰邦生物製品有限公司於2013年2月4日申請的發明專利，該專利的申請號為2013100417477，公布號為CN103185710A，授權公布日為2013年7月3日，發明人是馬莉、孫盼、李長清、袁靖、陳雲華、劉欣晏、楊剛。
《人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ檢測方法》包括①將IVIG樣品與一種經特殊預處理的人乏血小板血漿（PPP）混合；②向反應體系中添加含有磷脂劑的凝血酶特異螢光底物；③添加起始因子啟動TGT，該起始因子組分包括一種鈣離子源、一種磷脂劑；④最佳化的反應體系獲得提供參數的凝血酶生成曲線；⑤受檢樣品凝血酶含量達到峰值時所需時間TTP與樣品中所含FXIa水平呈負有關。將受檢樣品TTP與FXIa標準品TTP進行比較，可以間接獲得受檢樣品中FXIa的水平。這種活化凝血因子FXIa的檢測方法，適用於人靜脈注射丙種球蛋白（IVIG）製品中殘留的微量FXIa的檢測，及用於體外評估相關製品的致栓性風險。
2016年12月7日，《人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ檢測方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ檢測方法
- 公布號：CN103185710A
- 授權日：2013年7月3日
- 申請號：2013100417477
- 申請日：2013年2月4日
- 申請人：中國醫學科學院輸血研究所、貴州泰邦生物製品有限公司
- 地址：貴州省貴陽市花溪區竹林村大黔路156號
- 發明人：馬莉、孫盼、李長清、袁靖、陳雲華、劉欣晏、楊剛
- Int.Cl.：G01N21/64(2006.01)I
- 代理機構：貴陽中工智慧財產權代理事務所
- 代理人：陳忠俊
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
截至2013年2月，IVIG是由B型肝炎疫苗免疫的健康人血漿經低溫乙醇蛋白分離法提取的免疫球蛋白組分，經深加工和病毒滅活等步驟精製而成。IVIG具有免疫替代和免疫調節的雙重治療作用，臨床使用廣泛。隨著IVIG臨床使用數量的增加，該製品輸注人體後產生的不良反應事件也逐漸增加，危害嚴重。研究表明，此類血液製品中殘存的微量凝血激活物—FXIa是導致患者發生血栓的主要誘因。2013年2月前國際尚未出台關於IVIG致栓性的強制檢測規定。
2013年2月前《中國藥典》2010年版三部附錄IXO規定，非活化的部分凝血活酶時間（Non-activated partial thromboplastin time，以下簡稱NAPTT法）可用於定性檢測血液製品（如凝血因子濃縮物）中有無活化凝血因子。其檢測原理是將待檢測樣本加入到枸櫞酸抗凝的正常人血漿中，再加入一定濃度的磷脂、Ca後測定樣品凝塊形成時間。2013年2月前該方法存在以下不足：①僅能定性，無法實時監測樣品中凝血酶生成過程的變化；②僅能通過樣品凝固時間判定結果，人為因素影響較大，無法準確測定樣品中活化凝血因子的具體含量。
傳統NAPTT法的操作步驟為：（1）製備缺血小板人血漿（Platelet-poor plasma，以下簡稱PPP）：無菌採集人全血於3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑（9：1）中，混勻，以1500轉/分鐘，4℃離心30分鐘。用塑膠注射器取上層2/3血漿，以3500轉/分鐘，4℃離心30分鐘，取上層2/3血漿，分裝於塑膠管中，每支3毫升，保存-40℃備用；（2）將PPP與腦磷脂懸液混合，37℃放置1分鐘，加經稀釋的供試品溶液0.1毫升，然後加入已預熱至37℃的0.025摩爾/升氯化鈣溶液0.1毫升，記錄凝固時間。同時做空白對照。結果判定：空白對照凝固時間不低於200秒，實驗成立。1:10和1:100供試品稀釋液凝固時間應不低於150秒。
基於上述因素，《人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ檢測方法》通過最佳化反應體系和反應條件，建立基於凝血酶生成試驗（Thrombin generation test，以下簡稱TGT）法檢測IVIG中FⅪa的新方法，該方法具有良好的重複性，可準確定量檢測樣品中FⅪa的含量，進一步減少了人為誤差，有效確保了試驗結果的真實性和可靠性。
發明內容
專利目的
《人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ檢測方法》的目的是克服2013年2月前檢測技術所存在的上述不足，建立一種準確度好、靈敏度高的基於TGT法檢測IVIG中FXIa的方法，該方法適用於IVIG製品中微量FXIa的檢測。
技術方案
《人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ檢測方法》的操作步驟與NAPTT法不一致，其技術解決方案為：
（1）枸櫞酸鈉抗凝血漿中加入玉米胰蛋白酶抑制物，可特異、有效地避免因在採血過程中凝血因子Ⅺ的預活化，從而得到不含FⅪa的血漿，從而分離製備出不含FⅪa的PPP；
（2）反應體系中加入凝血酶特異性螢光底物，特異的凝血酶螢光底物以及磷脂劑濃度的確定：凝血酶特異性螢光底物選擇B-VA-AMC，對不同濃度底物進行篩選，其中底物工作濃度為1~7毫摩爾/升；磷脂劑選則腦磷脂，選擇工作濃度為1~3.5微摩爾/升；利用分光光度計連線計算機對凝血過程進行掃描，通過螢光信號強弱，可間接反映凝血酶生成含量變化，最後繪製動力學曲線；
（3）不同含量的FⅪa標準品或IVIG樣本中加入含磷脂劑的凝血酶螢光底物以及鈣離子源啟動凝血酶生成反應，反應結果通過螢光分光光度計監測凝血酶生成過程中螢光值的變化，最後使用GraphPad軟體處理數據得到凝血酶生成曲線，將受檢樣品的凝血酶生成濃度達到峰值所需的時間（Peak time of thrombin，以下簡稱TTP）與FⅪa標準品的TTP進行比較，可以間接獲得受檢樣品中FⅪa的水平。
有益效果
①將IVIG樣品與一種經特殊預處理的人PPP混合；②向反應體系中添加含有磷脂劑的凝血酶特異螢光底物；③添加起始因子啟動TGT，該起始因子組分包括一種鈣離子源、一種磷脂劑；④對最佳化的反應體系進行TGT，獲得提供參數的凝血酶生成曲線；⑤受檢樣品TTP與樣品中所含FXIa水平呈負有關。將受檢樣品TTP與FXIa標準品TTP進行比較，可以間接獲得受檢樣品中FXIa的水平。該發明是以TGT為原理，建立一種穩定、特異、靈敏的FXIa的檢測方法，該法適用於IVIG製品中殘留的微量FXIa的檢測，可用於體外評估相關製品的致栓性風險。
技術領域
《人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ檢測方法》屬於生物醫藥技術領域，涉及一種人靜脈注射免疫球蛋白（pH4，Human intravenous immunoglobulin，以下簡稱IVIG）中活化凝血因子Ⅺ（Activated coagulation factor XI，以下簡稱FXIa）的檢測方法。該法可以精確的檢測出IVIG中FXIa的具體含量，靈敏度可達0.12納摩爾/升。
權利要求
1.人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ檢測方法，其特徵是按以下步驟進行：（1）枸櫞酸鈉抗凝血漿中加入玉米胰蛋白酶抑制物，可特異、有效地避免因在採血過程中F凝血因子Ⅺ的預活化，從而得到不含活化凝血因子（FXIa）的血漿，從而分離製備出不含活化凝血因子（FXIa）的PPP；
（2）反應體系中加入凝血酶特異性螢光底物，特異的凝血酶螢光底物以及磷脂劑濃度的確定：凝血酶特異性螢光底物選擇B-VA-AMC，對不同濃度底物進行篩選，其中底物工作濃度為1~7毫摩爾/升；磷脂劑選則腦磷脂，選擇工作濃度為1~3.5微摩爾/升；利用分光光度計連線計算機對凝血過程進行掃描，通過螢光信號強弱，可間接反映凝血酶生成含量變化，最後繪製動力學曲線；
（3）不同含量的活化人凝血因子FXIa標準品或人靜脈注射丙種球蛋白樣本中加入含磷脂劑的凝血酶螢光底物以及鈣離子源啟動凝血酶生成反應，反應結果通過螢光分光光度計檢監測凝血酶生成過程中螢光值的變化，最後使用GraphPad軟體處理數據得到凝血酶生成曲線，將受檢樣品的凝血酶生成含量達到最高時所需時間TTP與FXIa標準品的TTP進行比較，可以間接獲得受檢樣品中FXIa的水平。
實施方式
1.製備不含FXIa的PPP
血漿使用靜脈穿刺法采自健康獻血者。1:9比例的枸櫞酸鈉抗凝血漿中加入濃度為40-150μg/毫升玉米胰蛋白酶抑制物，混勻，然後4℃離心，1500轉/分鐘，30分鐘。用塑膠注射器取上層2/3血漿，以3500轉/分鐘，4℃離心30分鐘，取上層2/3血漿，分裝於塑膠管中，每支2毫升，-40℃保存備用。
2.建立基於TGT的FXIa檢測方法
（1）最佳化底物濃度
選擇凝血酶特異性螢光底物Boc-Val-Arg-AMC.HCL，可以穩定、特異地反映TGT生成過程的變化。凝血酶特異性螢光底物Boc-Val-Arg-AMC.HCL難溶於Hepes緩衝液，所以操作過程中先用1/50體積的二甲基亞碸充分溶解，再用Hepes緩衝液稀釋至所需要的體積。不同濃度的底物對TGT有直接影響，故對凝血酶特異性螢光底物Boc-Val-Arg-AMC.HCL濃度進行最佳化。底物濃度為1～7毫摩爾/升時，凝血酶生成時間和螢光信號較合適。
（2）最佳化磷脂劑濃度
含有凝血酶特異性螢光底物的反應緩衝液中還應添加一定濃度的磷脂劑，才能使得凝血酶生成反應得以進行，磷脂劑選擇常規凝血實驗中使用的腦磷脂，考察不同濃度腦磷脂對凝血酶生成的影響，表明腦磷脂濃度對凝血酶生成影響不大，選擇VeenaC.等[Haematologicajouralofhematology200388（05）547-554]所使用的1～3.5微摩爾/升。
3.利用已建立的FⅪa檢測方法，比較不同含量的FXIa標準品對TGT影響
配製不同濃度的FⅪa標準品，利用2中已建立的基於TGT的FⅪa檢測方法，比較不同含量的FXIa標準品對凝血酶生成影響，試驗所得的數據經GrapgPadPrism作圖軟體中的enzymekinetics-MichaelisMenten數據模式處理後，以時間為X軸、螢光變化值（第n+1次螢光值-第n次螢光值）為Y軸得到平滑的凝血酶生成動力學曲線，從圖可以進行計算。
4.IVIG樣本中FXIa含量的檢測
利用2中已建立的基於TGT的FXIa檢測方法，比較不同IVIG樣本中FXIa對凝血酶生成的影響。受檢樣品的TTP與樣品中所含FXIa水平有關。將受檢樣品的TTP與FXIa標準品的TTP進行比較，可以間接獲得受檢樣品中FXIa的水平。
縮寫 | 英文名稱 | 中文名稱 |
IVIG | Human intravenous immunoglobulin | 人靜脈注射免疫球蛋白 |
FXIa | Activated coagulation factor XI | 活化凝血因子XI |
NAPTT | Non-activated partial thromboplastin time | 非活化的部分凝血活酶時間 |
PPP | Platelet-poor plasma | 缺乏血小板血漿 |
TGT | Thrombin generation test | 凝血酶生成試驗 |
TTP | Peak time of thrombin | 凝血酶生成濃度達到峰值所需的時間 |
榮譽表彰
2016年12月7日，《人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ檢測方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
