亞硝酸鹽應激誘導凡納濱對蝦細胞凋亡的調控機理研究

《亞硝酸鹽應激誘導凡納濱對蝦細胞凋亡的調控機理研究》是依託華南師範大學，由葉超霞擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：亞硝酸鹽應激誘導凡納濱對蝦細胞凋亡的調控機理研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：葉超霞
• 依託單位：華南師範大學

項目摘要

亞硝酸鹽在水產養殖中是誘發暴發性疾病的重要環境因子！我們的前期研究工作表明，亞硝酸鹽應激能誘導對蝦血細胞凋亡率升高。細胞凋亡可能是對蝦應對環境脅迫的一種保護性策略。本項目以南方廣泛養殖的凡納濱對蝦為研究對象，首先探明亞硝酸鹽脅迫下對蝦細胞凋亡發生的規律，確定引起細胞凋亡發生改變的關鍵亞硝酸鹽濃度和脅迫時間；在此基礎上，運用雙向電泳分析亞硝酸鹽應激前後對蝦的蛋白質差異，篩選與細胞凋亡相關的差異蛋白進行質譜分析和生物信息學分析；最後，本研究擬進一步藉助抑制性消減雜交技術，構建凡納濱對蝦在亞硝酸鹽應激前後的差異表達基因消減文庫，並篩選克隆出與細胞凋亡緊密相關的基因，進行功能分析，明確它們在調控機體細胞凋亡中的作用。本研究從生產實際中選題，研究成果對於蝦類的健康養殖具有深遠的現實意義；本項目初步揭示亞硝酸鹽應激誘導凡納濱對蝦細胞凋亡的調控機理，這對深入研究甲殼動物防禦的分子機理具有重要的理論意義。

結題摘要

亞硝酸鹽是細菌硝化作用和生態系統中脫氮作用過程的中間產物。通常情況下，生態系統中細菌硝化作用和反硝化作用處於一個動態平衡狀態。 然而， 隨著水產動物集約化養殖的發展，水質污染加劇，環境中亞硝酸鹽的含量不斷上升，成為水產養殖中誘發爆發性疾病的重要環境因子。以往由於研究技術限制等原因，關於亞硝酸鹽對水產動物毒性作用的研究多數停留在半致死濃度，以及對生理生化代謝和免疫功能的影響等方面， 其具體應激作用機制仍有待深入研究。 本研究首先利用流式細胞術檢測了亞硝酸鹽應激下凡納濱對蝦血細胞中的一氧化氮含量、活性氧含量、酯酶活力和細胞凋亡率，然後檢測了血細胞中凋亡相關基因、抗氧化酶系統和抗應激基因mRNA水平的變化，發現凡納濱對蝦啟動了抗氧化酶系統和抗應激基因來應對亞硝酸鹽應激造成的氧化損傷。以此為基礎，我們最佳化以對蝦肝胰腺為材料的蛋白質雙向電泳技術，分析凡納濱對蝦在亞硝酸鹽脅迫前後的蛋白質差異，鑑定出了33個差異蛋白點，對差異蛋白點進行質譜鑑定以後發現，亞硝鹽應激顯著影響了免疫、凋亡、抗氧化酶、解毒相關蛋白的表達水平。然後，我們利用Illumina測序技術構建了亞硝酸鹽應激下凡納濱對蝦的轉錄組文庫，獲得了平均長度為561 bp的Unigenes42,336條，用NCBI蛋白質資料庫（Nr），非冗餘核苷酸資料庫，基因本體論（GO），直系同源基因簇（COG）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）資料庫做參考，共注釋了23,532條Unigenes，揭示了凡納濱對蝦轉錄組豐富的信息。基於獲得的轉錄組數據，我們構建了凡納濱對蝦在亞硝酸鹽脅迫前後的數字基因表達譜，共發現1922個差異表達的基因，這些差異性表達基因對亞硝酸鹽處理後的反應是一個整體調控網路。為了了解這些基因在機體應對環境脅迫中的作用，我們對KEGG的多條通路進行了綜合分析，發現亞硝酸鹽應激48 h後，不僅導致了免疫相關基因的變化，同時也誘發了外源物質的降解與代謝、DNA複製和修復相關基因的變化。 本研究初步構建了亞硝酸鹽應激下凡納濱對蝦的細胞和分子回響調控網路。研究成果進一步擴展了甲殼動物的基因庫，為探索新基因的序列和功能提供了有效的信息， 為深入研究亞硝酸鹽對凡納濱對蝦毒性效應的分子機制以及對蝦抗脅迫防禦機理奠定了基礎。對於提高對蝦抗環境脅迫和抗病原感染的能力、降低亞硝酸鹽的危害，促進蝦類的健康養殖具有重要的現實意義。