乙醇發酵條件下的菊粉酶表達機制及調控

《乙醇發酵條件下的菊粉酶表達機制及調控》是依託大連理工大學,由袁文杰擔任醒目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：乙醇發酵條件下的菊粉酶表達機制及調控
• 依託單位：大連理工大學
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：袁文杰

項目摘要

菊芋具有耐鹽耐旱等抗逆性能，可在不適宜於糧食和經濟作物生長的非耕地種植，是燃料乙醇生產可供選擇的糧食替代資源之一。克魯維酵母能夠分泌菊粉酶，同時糖化發酵菊芋為乙醇，是實現菊芋生物煉製的最好選擇。但發酵過程中出現菊粉酶分泌受到抑制的現象，制約了其工業化進程。本課題針對菊芋乙醇發酵過程中出現的菊粉酶酶活低，水解速率慢問題，利用酶學分析、HPLC/LC-MS等手段監測細胞內外的代謝物、核苷酸, 利用數字表達譜檢測相關代謝途徑基因轉錄水平的變化，解析菊粉酶分泌機制，闡明該酶的誘導及阻遏機理；針對發現的關鍵基因，結合基因敲除、基因過表達等手段進行改造，使得產酶、糖化和乙醇發酵速率匹配，提高乙醇發酵效率。該研究有助於深入理解菊粉酶的表達機制，為微生物細胞工廠代謝菊芋積累其他初級代謝產物（如檸檬酸、乳酸、甘露醇等）提供指導，並對開發纖維素類生物質的一步法乙醇（CBP）發酵策略具有重要參考價值。

結題摘要

CBP發酵是集菊粉酶分泌、糖化、乙醇發酵於一體的技術。其中菊粉酶活力是最關鍵因素之一。本課題首先考察了不同碳源，碳源濃度對菊粉酶活性的影響，發現菊粉對菊粉酶的產生具有一定的誘導作用，而葡萄糖和果糖對產酶過程有一定程度的抑制作用。通氣量對酶活性的影響也很重要。外加15%乙醇對菊粉酶活力沒有影響。對菊粉酶啟動子序列進行了結構分析，發現存在5個潛在的底物結合位點。比較了不同長度的INU啟動子啟動活性的差異，進一步確定了其核心啟動區域。採用易錯PCR進行隨機突變，篩選到具有高啟動活性的啟動子，為菊粉酶在高底物濃度下活性的提高奠定了基礎，同時為其他類似酶的表達機制如纖維素酶提供了重要的參考。 建立了CBP乙醇發酵的方法，研究了通氣量對乙醇生產的影響。研究結果表明通氣量是影響整個發酵過程最關鍵的因素，在一定的通氣量條件下，發酵終點時間縮短、殘糖濃度降低，但是相應的乙醇得率依據特定通氣量有所降低。為精確控制通氣量，我們利用氧化還原電極控制氧化還原電位來表徵發酵系統中的溶氧。氧化還原電位控制在 -130 mV時的發酵結果最為理想，解決了乙醇得率與發酵時間及殘糖濃度之間的矛盾。並且證明了不通氣條件下發酵終點殘糖濃度過高的主要原因與細胞活性低密切相關。綜合胞外代謝物的數據，建立了不同條件下的碳流分布，明確了糖代謝途徑的差異。 套用RNA-Seq技術探討了K. marxianus在不同發酵條件下，如高糖與低糖、厭氧和好氧情況下關鍵基因的表達差異。基因組注釋工作結果共整合8條染色體，GO和KEGG資料庫分別注釋了8435和1882個基因。差異基因的分析涉及中心碳代謝途徑、乙醇生成以及甘油、乙酸等副產物代謝途徑、氧化壓力防禦途徑、糖轉運蛋白、轉錄調控相關基因和細胞自噬和線粒體氧化磷酸化相關基因。確定了導致發酵性能不同的可能候選關鍵基因。通過敲除和過表達特定基因，解除了菊粉酶的底物調控，使得產酶、糖化和乙醇發酵速率匹配，提高了K. marxianus乙醇發酵效率。