《一種鹽酸多柔比星脂質體注射劑及其製備工藝》是石藥集團中奇製藥技術（石家莊）有限公司於2009年5月26日申請的發明專利，該專利的申請號為2009100744504，公布號為CN101897667A，公布日為2010年12月1日，發明人是李春雷、王金戌、張莉、李彥輝、張蘭、郭文敏、申東民、王世霞、王彩霞、梁敏。
《一種鹽酸多柔比星脂質體注射劑及其製備工藝》其中各組分的重量百分含量為：鹽酸多柔比星0.05～0.5％、氫化大豆卵磷脂0.025～3％、膽固醇0.001～1.5％、聚乙二醇化脂0.01～1％、有機酸或硫酸銨0.0025～2.5％、糖2.8～20％、緩衝劑0.1～10％，其餘為注射用水。其製備工藝包括以下步驟：1）脂相凍乾；2）脂相水化；3）脂質體整粒；4）製造磷脂膜內外跨膜梯度；5）脂質體載藥；6）除菌、分裝、保存。
2014年11月6日，《一種鹽酸多柔比星脂質體注射劑及其製備工藝》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種鹽酸多柔比星脂質體注射劑及其製備工藝
- 公布號：CN101897667A
- 公布日：2010年12月1日
- 申請號：2009100744504
- 申請日：2009年5月26日
- 申請人：石藥集團中奇製藥技術（石家莊）有限公司
- 地址：河北省石家莊市中山西路276號
- 發明人：李春雷、王金戌、張莉、李彥輝、張蘭、郭文敏、申東民、王世霞、王彩霞、梁敏
- 分類號：A61K9/10（2006.01）I、A61K9/127（2006.01）I、A61K31/704（2006.01）I、A61K47/34（2006.01）I、A61P35/00（2006.01）I
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
多柔比星（doxorubicin，adriamycin，又稱阿黴素）為蒽環類抗生素，結構類似柔紅黴素，屬廣譜抗腫瘤藥。臨床上可適用於急性白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、睪丸癌、甲狀腺癌、軟組織腫瘤、骨肉瘤等。雖然鹽酸多柔比星抗腫瘤譜廣，療效高，但其具有較強的細胞毒效應，並且選擇性較差，既可以殺傷腫瘤細胞，又可以殺傷正常細胞，限制了其臨床套用。
台灣東洋藥品工業股份有限公司的專利CN100376249C和CN100431525C中採用的鹽酸多柔比星脂質體製備方法相似，將脂質組分溶於醇溶劑內形成混合物，將該混合物與硫酸銨水溶液混合，對所形成的混合物進行孔擠壓處理，得到脂質體懸浮液。此方法中，脂相溶解步驟使用了大量有機溶劑，靠透析僅能去除部分有機溶劑，有機溶劑殘留較多。
專利CN1133436C、CN1290511C和CN1256091C公開了薄膜分散法製備鹽酸多柔比星脂質體的方法，這些方法中採用氯仿或氯仿-甲醇混合溶劑溶解磷脂和膽固醇，有機溶劑殘留較多，毒性大，且薄膜分散法得到的脂相混合物緻密，不易水化，生產批量小，難以產業化。
Journal o fLiposome Research，3（3），517-528（1993）公開了一種PEG化阿黴素脂質體的製備工藝，將磷脂、聚乙二醇化脂、膽固醇和維生素E溶解於叔丁醇中，通過冷凍乾燥除去溶劑，疏鬆的脂質塊用含硫酸銨和去鐵銨的水溶液在60℃下強烈渦旋振搖水化60min，脂質體混懸液通過聚碳酸酯膜擠出整粒。叔丁醇的凝固點是25.5℃，操作時容易凝固，不利於脂相成分的溶解。
發明人於2007年申請了WO2008080367A1，該專利方法適用於如米托蒽醌這樣具有兩個或兩個以上可解離基團的藥物，且脂質體粒度為30-80納米。
該專利也公開了阿黴素脂質體的一種製備工藝（參見WO2008080367A1實施例8），將氫化大豆卵磷脂、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂酸磷脂醯乙醇胺溶解於95％叔丁醇水溶液中得澄明溶液，冷凍乾燥得凍乾粉末，以硫酸銨溶液水化，再以微射流進行整粒，粒子的平均粒度為60納米。採用超濾裝置移去空白脂質體外相的硫酸銨，將外相置換成250毫摩爾/升蔗糖及50毫摩爾/升甘氨酸以形成梯度，加入鹽酸阿黴素溶液，孵育1h後得到阿黴素脂質體混懸液。
與具有兩個生pH下可解離基團的米托蒽醌相比，具有一個可解離基團的阿黴素製成小粒度（60納米）脂質體後，體外釋放過快，會導致體內毒性大（參見WO2008080367A1實施例9）。另外該專利方法中採用水/叔丁醇混合溶劑溶解脂相成分，得到的溶液有一定的黏度，升華速度慢，凍乾需要的時間長。
發明內容
專利目的
《一種鹽酸多柔比星脂質體注射劑及其製備工藝》發明人在專利WO2008080367A1公開的脂質體製備工藝基礎上進行了改進，提供了一種鹽酸多柔比星脂質體注射劑及其製備工藝。
技術方案
該脂質體注射劑含有：1）鹽酸多柔比星；2）脂相成分：氫化大豆卵磷脂/膽固醇/聚乙二醇化脂；3）其他用於製備脂質體藥物的輔料。
其中各組分的重量百分含量為：鹽酸多柔比星0.05～0.5％、氫化大豆卵磷脂0.025～3％、膽固醇0.001～1.5％、聚乙二醇化脂0.01～1％、硫酸銨0.0025～2.5％、糖2.8～20％、緩衝劑0.1～10％，其餘為注射用水。
同時滿足：鹽酸多柔比星和氫化大豆卵磷脂的重量比為0.1～2:1，膽固醇和氫化大豆卵磷脂的重量比為0.1～1:2，聚乙二醇化脂和氫化大豆卵磷脂的重量比為0.07～7:2。
上述鹽酸多柔比星脂質體注射劑，其優選方案中各組分的重量百分含量為：鹽酸多柔比星0.1～0.3％、氫化大豆卵磷脂0.5～1.5％、膽固醇0.2～0.5％、聚乙二醇化脂0.2～0.5％、硫酸銨0.005～2％、糖2.8～15％、緩衝劑0.1～10％，其餘為注射用水。
其中，聚乙二醇化脂選自甲氧基PEG2000-二硬脂酸醯脂醯乙醇胺（MPEG2000-DSPE）、膽固醇-PEG（cholesterol-PEG）、甘油二酯-PEG（diacylglycerol-PEG）、DSPE多臂PEG（DSPE-Multi-armPEG）或DSPE樹狀PEG（DSPE-Comb-shapedPEG）。糖選自乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖或海藻糖。緩衝劑選自組氨酸或甘氨酸。
該脂質體注射劑的製備工藝包含以下步驟：
1）脂相凍乾：將氫化大豆卵磷脂/膽固醇/聚乙二醇化脂溶於乙醇/叔丁醇混合溶劑中，凍乾，除去有機溶劑，得到疏鬆的脂相混合物a；乙醇與叔丁醇的體積比大於0，小於等於1:9；
2）脂相水化：配製0.01～1M的硫酸銨水溶液，加到凍乾後的脂相混合物a中，在40～70℃的水浴中保溫振盪進行水化，得到粒度不均勻的脂質體b；
3）脂質體整粒：將b用微射流進行整粒，控制整粒遍數和操作壓力在7000～20000磅力/平方英寸，得到平均粒度為80～150納米的脂質體c；
4）製造脂質體內外跨膜梯度：以柱層析方法，用250～300毫摩爾/升的糖溶液，加入緩衝劑調節pH為5～8，作為外相溶液，置換原脂質體外相的硫酸銨溶液，得到空白脂質體d；
5）脂質體載藥：將鹽酸多柔比星溶於注射水或脂質體外相溶液中，配製濃度為5～20％的溶液，將該溶液和空白脂質體d混合，在40～70℃保溫一定時間，得鹽酸多柔比星脂質體混懸液e；
6）除菌、分裝、保存：將e於室溫下採用0.22微米微孔濾膜過濾除菌，分裝，即可得到鹽酸多柔比星脂質體注射劑。成品可在2～8℃條件下保存。
《一種鹽酸多柔比星脂質體注射劑及其製備工藝》中，採用乙醇/叔丁醇混合溶劑溶解脂相成分：叔丁醇是凍乾法中的常用溶劑，其凝固點高（25.5℃）容易凍結，蒸氣壓高（24.5℃時為5.33kPa）有利於升華，能夠節省凍乾時間，凍乾周期短，適合產業化；且叔丁醇毒性和乙醇相似，不會引起安全性問題。但其凝固點低所帶來的問題是操作時容易發生凝固，一旦凝固則無法溶解脂相成分。乙醇對脂相成分具有良好的溶解性，但其凝固點低（-114.1℃），若以乙醇做凍乾溶劑，需要的預凍溫度低，對設備要求高且能源消耗大。
發明人採用乙醇/叔丁醇做混合溶劑（乙醇與叔丁醇的體積比大於0，小於等於1:9），一方面可以使混合溶劑的凝固點下降，操作時保持液體狀態，有利於脂相成分的溶解；另一方面乙醇/叔丁醇溶解脂相成分時，所得溶液澄明，與水/叔丁醇混合溶劑溶解脂相成分所得溶液相比，基本無黏性，有利於後續操作。
將鹽酸多柔比星脂質體粒度控制在80～150納米間，與小粒度（比如60納米）的該藥脂質體相比，釋放減慢（見實施例1和對比例1）。
改善效果
採用乙醇/叔丁醇混合溶劑（乙醇與叔丁醇的體積比大於0，小於等於1:9）溶解脂相成分，操作時混合溶劑保持液體狀態，有利於脂相成分的溶解；所得溶液澄明，基本無黏性，有利於後續操作。
採用微射流對脂質體進行整粒，通過控制操作壓力和整粒遍數得到所需粒度的脂質體，均勻度好。且微射流整粒在整粒過程中物料暴露點少，時間短，有利於無菌保證，適合產業化。
將鹽酸多柔比星脂質體粒度控制在80～150納米間，解決了WO2008080367A1中，小粒度（60納米）鹽酸多柔比星釋放過快的問題。
權利要求
1.一種鹽酸多柔比星脂質體注射劑，其特徵在於其中各組分的重量百分含量為：鹽酸多柔比星0.05～0.5％、氫化大豆卵磷脂0.025～3％、膽固醇0.001～1.5％、聚乙二醇化脂0.01～1％、硫酸銨0.0025～2.5％、糖2.8～20％、緩衝劑0.1～10％，其餘為注射用水，
同時滿足：鹽酸多柔比星和氫化大豆卵磷脂的重量比為0.1～2:1，膽固醇和氫化大豆卵磷脂的重量比為0.1～1:2，聚乙二醇化脂和氫化大豆卵磷脂的重量比為0.07～7:2；
該注射劑的製備工藝包含以下步驟：
1）脂相凍乾：將氫化大豆卵磷脂/膽固醇/聚乙二醇化脂溶於乙醇/叔丁醇混合溶劑中，凍乾，除去有機溶劑，得到疏鬆的脂相混合物a；
2）脂相水化：配製0.01～1M的硫酸銨水溶液，加到凍乾後的脂相混合物a中，在40～70℃的水浴中保溫振盪進行水化，得到粒度不均勻的脂質體b；
3）脂質體整粒：將b用微射流整粒，控制整粒遍數和操作壓力在7000～20000磅力/平方英寸，得到平均粒度為80～150納米的脂質體c；
4）製造脂質體內外跨膜梯度：以柱層析方法，用250～300毫摩爾/升的糖溶液，加入緩衝劑調節pH為5～8，作為外相溶液，置換原脂質體外相的硫酸銨溶液，得到空白脂質體d；
5）脂質體載藥：將鹽酸多柔比星溶於注射水或脂質體外相溶液中，配製濃度為5～20％的溶液，將該溶液和空白脂質體d混合，在40～70℃保溫一定時間，得鹽酸多柔比星脂質體混懸液e；
6）除菌、分裝、保存：將e於室溫下採用0.22微米微孔濾膜過濾除菌，分裝，即可得到鹽酸多柔比星脂質體注射劑。
2.根據權利要求1所述的鹽酸多柔比星脂質體注射劑，其特徵在於其中各組分的重量百分含量為：鹽酸多柔比星0.1～0.3％、氫化大豆卵磷脂0.5～1.5％、膽固醇0.2～0.5％、聚乙二醇化脂0.2～0.5％、硫酸銨0.005～2％、糖2.8～15％、緩衝劑0.1～10％，其餘為注射用水。
3.根據權利要求1所述的鹽酸多柔比星脂質體注射劑，其特徵在於聚乙二醇化脂選自甲氧基PEG2000-二硬脂醯磷脂醯乙醇銨、膽固醇-PEG、甘油二酯-PEG、DSPE多臂PEG或DSPE樹狀PEG。
4.根據權利要求1所述的鹽酸多柔比星脂質體注射劑，其特徵在於糖選自乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖或海藻糖。
5.根據權利要求1所述的鹽酸多柔比星脂質體注射劑，其特徵在於緩衝劑選自組氨酸或甘氨酸。
實施方式
- 第一部分：脂質體注射劑製備
此部分提供了鹽酸多柔比星脂質體注射劑的完整製備方案（實施例1），所得注射劑用於第七部分的毒性及藥效學比較。還提供了按照WO2008080367A1中的方法製備的鹽酸多柔比星脂質體（對比例1）與《一種鹽酸多柔比星脂質體注射劑及其製備工藝》所得鹽酸多柔比星脂質體注射劑的體外釋放情況的對比。
實施例1鹽酸多柔比星脂質體注射劑製備
將HSPC（氫化大豆卵磷脂）、Chol（膽固醇）和DSPE-PEG2000（甲氧基PEG2000-二硬脂酸磷脂醯乙醇胺）按照（3:1:1）的重量比混合，溶於乙醇/叔丁醇（體積比為5:95）中，在凍乾機中凍乾除去有機溶劑，形成疏鬆的脂相混合物；配製300毫摩爾/升的硫酸銨溶液，加到凍乾後的脂相中，在60℃的水浴中保溫振盪30分鐘進行水化，得到不均勻的空白脂質體。將空白脂質體在微射流中整粒。將所獲得的樣品用濃度0.9％的NaCl溶液稀釋200倍後，NanoZS測定粒度，粒子的平均粒度為100納米。使用柱層析的方式將外相置換成250毫摩爾/升蔗糖及50毫摩爾/升甘氨酸，以形成磷脂膜內外的硫酸銨梯度。空白脂質體中加入含量為10％的鹽酸多柔比星溶液（加藥量按照藥物與HSPC的重量比為2:9.58計算），在55℃的水浴中保溫振盪1小時進行載藥。將所得脂質體混懸液用微孔濾膜過濾除菌，分裝，得鹽酸多柔比星脂質體注射劑，成品在2～8℃條件下保存。此處方被命名為pld100。
對比例1WO2008080367A1實施例8方法製備鹽酸多柔比星脂質體
將HSPC、Chol和DSPE-PEG2000按照（3:1:1）的重量比混合，在溶解於95％叔丁醇中，在凍乾機中凍乾除去有機溶劑，形成疏鬆的脂相混合物；制300毫摩爾/升的硫酸銨溶液，加到凍乾後的脂相中，在60℃的水浴中保溫振盪1h，得到不均勻的空白脂質體。最終的磷脂濃度為96毫克/毫升。之後使用微射流設備降低脂質體的粒度。將所獲得的樣品用濃度0.9％的NaCl溶液稀釋200倍後，用NanoZS進行檢測，粒子的平均粒度約為60納米。使用超濾裝置移去空白脂質體外相的硫酸銨，將外相置換成250毫摩爾/升蔗糖及50毫摩爾/升甘氨酸，以便形成跨膜硫酸銨梯度。在空白脂質體中加入含量為10％的鹽酸多柔比星溶液（加藥量按照藥物與HSPC的重量比為2:9.58計算），在55℃的水浴中保溫振盪1小時進行載藥。此處方被命名為pld60。
pld100與pld60的體外釋放情況對比：釋放的條件如下：將pld100與pld60用釋放介質稀釋25倍。釋放介質含有20毫摩爾/升的氯化銨，等滲，pH為7.4。將稀釋的脂質體裝在透析袋中，2毫升的脂質體稀釋液對400毫升釋放介質進行透析，在45℃進行釋放。不同時間點取樣進行分析，結果見表1：
表1：pld100與pld60的體外釋放情況對比
時間（分鐘） | 累計釋放百分率 | |
pld60 | pld100 | |
0 | 0.0% | 0.0% |
5 | 21.2% | 4.5% |
15 | 36.8% | 11.1% |
30 | 45.0% | 17.9% |
60 | 52.4% | 24.1% |
180 | 56.7% | 28.9% |
有上述結果可見，粒度為100納米的鹽酸多柔比星脂質體（pld100）較粒度為60納米的鹽酸多柔比星脂質體（pld60）體外釋放減慢。
- 第二部分：脂相混合
此部分分別對採用凍乾法、薄膜分散法和乙醇溶解法進行脂相混合的過程進行了描述，以便第三、四、五、六部分分別比較這三種方法對後續的水化、整粒、外相置換和載藥等過程的影響。
實施例2凍乾法進行脂相混合
將HSPC、Chol和DSPE-PEG2000按照（3:1:1）的重量比混合，溶於乙醇/叔丁醇（體積比為10:90）中；在凍乾機中凍乾除去有機溶劑，形成疏鬆的脂相混合物。
實施例3薄膜分散法進行脂相混合
將HSPC、Chol和DSPE-PEG2000按照（3:1:1）的重量比混合，溶於氯仿中，在旋轉蒸發儀中經減壓蒸發除去有機溶劑，得到脂質乾膜。
實施例4乙醇溶解法進行脂相混合
將HSPC、Chol和DSPE-PEG2000按照（3:1:1）的重量比混合，溶於乙醇中，在60℃水浴中震盪30分鐘，脂相成分全部溶解，得到脂相醇溶液。
- 第三部分：脂質體水化
此部分比較了採用凍乾法、薄膜分散法和乙醇溶解法進行脂相混合對後續水化過程的影響。
實施例5不同工藝得到的脂相混合物水化過程比較
將實施例2、3和4中得到的脂相混合物分別加入300毫摩爾/升的硫酸銨溶液，60～65℃震盪水化，得到不均勻的多室脂質體。最終的磷脂濃度均為9.6毫克/毫升。
水化30分鐘時3份樣品均無肉眼可見團塊或不溶性顆粒，分別取樣在電子顯微鏡下觀察，實施例2和實施例4得到的脂相混合物水化完全，顯微鏡下沒有觀察到聚集團塊。實施例3得到的脂相混合物仍有大量聚集團塊。將其繼續水化1.5小時，顯微鏡下觀察，沒有聚集團塊。可見，組成完全相同的三種脂相成分，用凍乾法和乙醇溶解法得到的混合物容易水化。
- 第四部分：脂質體整粒
此部分比較了採用凍乾法、薄膜分散法和乙醇溶解法進行脂相混合對後續整粒過程的影響。
實施例6擠壓整粒過程比較
將實施例5得到的3份空白脂質體在擠出裝置中選用80納米膜進行擠出整粒，當發生堵膜時則更換孔徑更大的膜片，採用NanoZS測定粒度，結果見表2。
樣品 | 第一遍 | 第二遍 | 第三遍 |
實施例2 | 80納米膜，堵膜 | 更換100納米膜，在500磅力/平方英寸壓力下過膜，粒度為108納米 | 更換80納米膜，粒度92.6納米 |
實施例3 | 80納米膜，堵膜 | 更換100納米膜，堵膜 | 更換0.22微米膜，仍堵膜 |
實施例4 | 80納米膜，堵膜 | 更換100納米膜，在480磅力/平方英寸壓力下過膜，粒度為105納米 | 更換80納米膜，粒度98.7納米 |
由擠壓整粒過程可見，三份樣品第一遍以80納米膜擠出時都出現了堵膜現象，需要先用孔徑較大的膜片處理，操作繁瑣，且更換膜片時易導致細菌污染。
實施例3薄膜分散法得到的脂質體堵膜嚴重，更換孔徑更大的膜片後仍然不能繼續擠出，說明薄膜分散法得到的脂質體不利於整粒。
實施例7微射流整粒過程比較
將實施例5得到的3份空白脂質體在微射流中整粒，調整壓力為14500磅力/平方英寸，控制進料溫度為60℃，整粒遍數為3遍。用納米粒度儀（NanoZS）進行粒度測定，結果見表3。
粒度（納米）/樣品 | 整粒遍數 | ||
第一遍 | 第二遍 | 第三遍 | |
實施例2 | 90.2 | 88.6 | 84.8 |
實施例3 | 120.3 | 112.0 | 106.6 |
實施例4 | 95.5 | 90.4 | 89.8 |
由粒度測定結果可見，實施例2凍乾法和實施例4乙醇溶解法得到的脂質體容易整粒，整粒3遍後即可得到較小的粒度。而實施例3薄膜分散法得到的脂質體，經相同遍數整粒後，粒度最大，說明該方法得到的脂質體不利於整粒。
- 第五部分：脂質體外相置換
此部分比較了採用凍乾法、薄膜分散法和乙醇溶解法進行脂相混合對後續脂質體外相置換過程的影響。
實施例8柱層析進行外相置換，並測定有機溶劑殘留
配製250毫摩爾/升蔗糖、50毫摩爾/升甘氨酸溶液，用0.1N氫氧化鈉調節pH6.5，得外相溶液。將以上整粒後的三份脂質體在葡聚糖凝膠裝柱上進行柱層析，用外相溶液沖柱。
由於三份脂質體脂相混合時都用到了有機溶劑，實施例2用到了叔丁醇，實施例3用到了氯仿，實施例4用到了乙醇。按照有機溶劑毒性分類，氯仿屬於毒性不太大應限制使用的二類溶劑，叔丁醇和乙醇屬於低毒的三類溶劑，製劑中的有機溶劑應儘可能除去，殘留水平不能高於安全值。參照ICHQ3C殘留溶劑的指導原則，氯仿濃度限度為60ppm（0.006％），叔丁醇柱層析後的三份脂質體分別進行有機溶劑殘留，結果見表4。
樣品 | 實施例2 | 實施例3 | 實施例4 |
有機溶劑殘留 | 未檢測到 | 0.017% | 0.092% |
結果可見，凍乾法得到的脂質體有機溶劑殘留最低。
- 第六部分：脂質體載藥
此部分比較了採用凍乾法、薄膜分散法和乙醇溶解法進行脂相混合對後續脂質體載藥的影響。
實施例9
實施例8得到的脂質體中加入含量為10％的鹽酸多柔比星水溶液（鹽酸多柔比星與HSPC的重量比為2:9.58），在55～65℃的水浴中保溫振盪1小時進行載藥。
使用凝膠排阻色譜法測定包封效率，三份樣品的包封率均在98％～100％。
- 第七部分：鹽酸多柔比星脂質體注射劑與鹽酸多柔比星溶液的毒性及藥效學比較
實施例10毒性比較試驗
按實施例1方法製備鹽酸多柔比星脂質體注射劑，將鹽酸多柔比星溶於5％葡萄糖注射劑製備鹽酸多柔比星游離藥物溶液。
脂質體注射劑給藥劑量為24、28、32和36毫克/千克，游離藥物給藥劑量為16、20、24、28和32毫克/千克，給藥容積為20毫升/千克。
分別單次尾靜脈給予KM小鼠，觀察期為15天。脂質體24毫克/千克、游離藥16和20毫克/千克動物生存至實驗結束。數據採用SPSS11.5統計軟體Survival的Kaplan-Meier過程進行生存分析。結果見表5。
組別 | 劑量 （毫克·千克） | 動物只數 | 死亡只數 | 生存時間（x±S） | 生存率（%） | |
平均生存時間（天） | 中位生存時間（天） | |||||
游 離 藥 | 16 | 5 | 0 | N | N | 100 |
20 | 5 | 0 | N | N | 100 | |
24 | 5 | 5 | 10.60±1.17 | 11.00±2.19 | 0 | |
28 | 5 | 5 | 8.20±0.20 | 8.00 | 0 | |
32 | 5 | 5 | 7.40±0.24 | 7.00 | 0 | |
脂 質 體 | 24 | 5 | 0 | N | N | 100 |
28 | 5 | 1 | 13.60±1.25 | N | 80 | |
32 | 5 | 5 | 10.60±1.03 | 11.00±0.89 | 0 | |
36 | 5 | 5 | 10.20±1.16 | 10.00±1.10 | 0 | |
N：所有動物在觀察期結束時無死亡或死亡數少，不能計算生存時間。
實驗結果表明相同劑量的鹽酸多柔比星脂質體注射劑與游離藥組相比可以顯著降低由藥物毒性引起的動物死亡（P＜0.05）。
實施例11脂質體注射劑與游離藥物對白血病L1210腹水瘤BDF1小鼠生存時間的影響
收集L1210腹水細胞，稀釋後以5×10/0.2毫升/只腹腔接種於7～8周齡BDF1雌性小鼠，24小時後隨機分為4組：5％葡萄糖注射液組、游離藥物（8.0毫克/千克）治療組和脂質體注射劑（8.0和12.0毫克/千克）治療組。各組分別尾靜脈單次注射給藥，給藥容積為20毫升/千克。給藥後動物正常飼養，觀察動物一般狀況及生存情況，實驗觀察至接種後60天。
L1210腹水瘤是一個致死的動物模型，通過比較動物的生存時間來評價藥物的治療效果。數據採用SPSS 11.5統計軟體Survival的Kaplan-Meier過程進行生存分析。結果見表6。
組別 | 劑量 （毫克/千克） | 動物只數 | 死亡只數 | 生存時間（X±S）（95%可信區間） | 生存率 （%） | |
平均生存時間（天） | 中位生存時間（天） | |||||
5%葡萄糖 注射液組 | - | 9 | 9 | 9.11±0.20 | 9.00±0.21 | 0 |
（8.72〜9.50） | （8.59-9.41） | |||||
游離藥物 治療組 | 8.0 | 11 | 11 | 13.18±0.66 | 13.00±0.37 | 0 |
（11.89〜14.47） | （12.28〜13.72） | |||||
脂質體藥 物治療組 | 8.0 | 11 | 8 | 29.09±5.83 | 19.00±2.20 | 27.27 |
（17.66〜40.53） | （14.68〜23.32） | |||||
12.0 | 12 | 7 | 40.08±15.21 | 33.00±9.53 | 41.67 | |
（29.87〜50.30） | （14.33~51.67） | |||||
結果顯示，5％葡萄糖注射液組動物腹腔接種L1210細胞後在9天左右全部死亡，藥物治療均可以顯著延長動物生存時間（P＜0.05）。與等劑量的游離藥相比，鹽酸多柔比星脂質體注射劑可以顯著延長動物的生存時間（P＜0.05）。
實施例12脂質體注射劑與游離藥物對L1210肝轉移模型小鼠生存時間的影響
收集L1210腹水細胞，稀釋後以5×10/0.2毫升/只靜脈接種於7～8周齡BDF1雌性小鼠，24小時後隨機分為4組：5％葡萄糖注射液組、游離藥物（8.0毫克/千克）治療組和脂質體藥物（8.0和12.0毫克/千克）治療組。各組分別尾靜脈單次注射給藥，給藥容積為20毫升/千克。給藥後動物正常飼養，觀察動物一般狀況及生存時間，實驗觀察至接種後60天。數據採用SPSS11.5統計軟體Survival的Kaplan-Meier過程進行生存分析。
L1210細胞靜脈接種於動物後，多數腫瘤細胞轉移至肝臟引起動物死亡，通過比較動物生存時間來評價藥物的治療作用。結果見表7。
組別 | 劑量（毫克/千克） | 動物 只數 | 死亡 只數 | 生存時間（x±s）（95%可信區間） | 生存率 （%） | |
平均生存時間（天） | 中位生存時間（天） | |||||
5%葡萄糖注 射液組 | - | 8 | 8 | 11.00±0.0 | 11.00 | 0 |
（11.00-11.00） | ||||||
游離藥物治 療組 | 8.0 | 8 | 8 | 11.88±0.88 | 11.00 | 0 |
（10.16-13.59） | ||||||
脂質體藥物 治療組 | 8.0 | 8 | 0 | N | N | 100 |
12.0 | 8 | 0 | N | N | 100 | |
N：所有動物在觀察期60天結束時無死亡，不能計算生存時間。
實驗結果顯示，動物靜脈接種L1210細胞後，5％葡萄糖注射液組通常在接種後11天死亡，游離藥8.0毫克/千克組6隻動物在接種後11天死亡，另2隻在17和18天死亡。8.0和12.0毫克/千克鹽酸多柔比星脂質體組所有動物均生存至實驗結束，相同劑量的鹽酸多柔比星脂質體與游離藥組相比可以顯著延長動物的生存時間（P＜0.05）。實驗結果說明鹽酸多柔比星製成脂質體注射劑後可以顯著延長動物生存數量和生存時間。
上述毒性及藥效結果（實施例10～12）表明鹽酸多柔比星脂質體注射劑與游離藥物相比，毒性降低，對白血病L1210腹水瘤有明顯的治療效果，且療效大大優於游離藥物。
榮譽表彰
2014年11月6日，《一種鹽酸多柔比星脂質體注射劑及其製備工藝》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
