《一種脫細胞角膜基質及其製備方法》是深圳艾尼爾角膜工程有限公司於2014年6月13日申請的專利，該專利的公布號為CN104001215A，公布日為2014年8月27日，發明人是王維博、張斌。該發明涉及醫療器械領域。
《一種脫細胞角膜基質及其製備方法》包括以下步驟：A、將摘取的動物角膜放入水中，振盪處理，以使上皮層脫落；B、將水更換為脫細胞試劑，振盪處理，期間，所述脫細胞試劑和水交替使用，以使基質細胞和內皮細胞脫落；C、加入脫水劑，靜置或振盪處理，得到脫細胞角膜；D、將所述脫細胞角膜進行削切，得到脫細胞角膜基質，所述脫細胞角膜基質只含有前彈力層和基質層；其中，所述脫細胞試劑含有NaCl和EDTA，所述脫水劑含有甘油。該發明提供的脫細胞角膜基質的製備方法，能有效的去除容易引起免疫反應的角膜細胞成分和可溶性蛋白，得到完好的只含有前彈力層和基質層的脫細胞角膜基質。
2017年12月11日，《一種脫細胞角膜基質及其製備方法》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
（概述圖為《一種脫細胞角膜基質及其製備方法》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：一種脫細胞角膜基質及其製備方法
- 申請人：深圳艾尼爾角膜工程有限公司
- 申請日：2014年6月13日
- 申請號：201410264542X
- 公布號：CN104001215A
- 公布日：2014年8月27日
- 發明人：王維博、張斌
- 地址：廣東省深圳市龍崗區布吉街道甘李工業園甘李六路12號中海信科技園廠房第1棟B座101-102
- 分類號：A61L27/36(2006.01)I、A61L27/50(2006.01)I
- 代理機構：深圳市世紀恆程智慧財產權代理事務所
- 代理人：胡海國、李霞
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
角膜病是全球範圍內第二致盲眼病，並且以每年150～200萬病例的速度遞增。角膜移植是2014年前治療角膜盲唯一有效的方法，但供體角膜來源的極端匱乏制約著角膜移植的開展。角膜基質如動物等動物的角膜基質具有與人角膜基質類似的組織結構、生物物理特性和光學特性，但異種移植後強烈的排斥反應阻礙了異種角膜在臨床上的套用。截至2014年6月的研究發現，角膜基質內的基質細胞是引起基質型排斥反應的主要抗原，而作為角膜基質架構的膠原纖維在種系間高度保守，抗原性很低，無細胞的異種角膜移植後不產生排斥反應。因此，將動物的基質細胞完全脫去，使之成為無細胞的角膜基質可能是人角膜基質的理想替代物。
但2014年6月之前的技術生產的無細胞角膜基質在脫細胞過程中，採用的是胰酶、EDTA（乙二胺四乙酸）等溶液以及Triton-X100（聚乙二醇辛基苯基醚）、脫氧膽酸鈉、SDS（十二烷基磺酸鈉）等表面活性劑，此類方法雖然能去除細胞成分，但反應劇烈，對角膜基質破壞嚴重，不能達到良好的生物相容性。此外，2014年6月之前的技術生產的脫細胞角膜基質為全層角膜，臨床使用前需根據創面大小以及深度進行處理後才能使用，在操作過程中材料被污染的幾率增大，基質層容易被破壞，且處理後的角膜基質層表面不平整，不利於創面癒合。
發明內容
專利目的
該發明的主要目的在於提供一種脫細胞角膜基質的製備方法，旨在快速而溫和地去除角膜中免疫原細胞成分和可溶性蛋白，從而得到只含有前彈力層和基質層的脫細胞角膜基質。
技術方案
《一種脫細胞角膜基質及其製備方法》包括以下步驟：
A、將摘取的動物角膜放入水中，振盪處理，以使上皮層脫落；
B、將水更換為脫細胞試劑，振盪處理，期間，所述脫細胞試劑和水交替使用，以使基質細胞和內皮細胞脫落；
C、加入脫水劑，靜置或振盪處理，得到脫細胞角膜；
D、將所述脫細胞角膜進行削切，得到脫細胞角膜基質，所述脫細胞角膜基質只含有前彈力層和基質層；
其中，所述脫細胞試劑含有NaCl和EDTA，所述脫水劑含有甘油。優選地，所述脫細胞試劑為：濃度為2～5摩爾/升的NaCl溶液與濃度為0.5～5克/升的EDTA溶液的混合液。優選地，所述脫細胞試劑的pH值為7.0～7.4；所述脫細胞試劑和/或水的溫度均為2～37℃。
優選地，所述A步驟的振盪時間為5～10小時，期間，每隔1～2小時更換一次水；所述B步驟的振盪時間為40～70小時，期間，每隔1～2小時交替更換一次脫細胞試劑或水。優選地，所述脫水劑中甘油的體積比為50～90％。
優選地，在所述C步驟之後、D步驟之前還包括以下步驟：X、使用濃度為2～5克/升碳酸氫鈉溶液清洗所述動物角膜2～10分鐘。
優選地，在所述A步驟之後、B步驟之前還包括以下步驟：Y、將水更換成濃度為0.02～2‰的次氯酸鈉溶液，靜置10～60分鐘。優選地，在所述D步驟之後，還包括以下步驟：Z、將所述脫細胞角膜基質用鈷-60輻照。
此外，為實現上述目的，該發明還提供一種脫細胞角膜基質，由前述製備方法製備得到。優選地，所述脫細胞角膜基質的厚度為150～550微米，直徑為0.5～1.2毫米。
改善效果
《一種脫細胞角膜基質及其製備方法》通過脫細胞試劑和水的交替使用，反覆改變組織滲透壓的方法，能逐步去除角膜基質中免疫原細胞成分和可溶性蛋白，從而得到完好的脫細胞角膜基質。此外，通過削切處理，可製備出只含有前彈力層和基質層的脫細胞角膜基質，臨床使用前只需醫生根據患者創面大小和深度選擇對應的規格型號，環鑽取得合適的直徑大小的脫細胞角膜基質即可使用。這樣，不僅操作簡單，又能避免污染。
附圖說明
圖1為該發明的脫細胞角膜基質一實施例的脫細胞處理前和脫細胞處理後的蘇木精-伊紅（HE）染色照片對比圖，其中，1A為脫細胞處理前的蘇木精-伊紅（HE）染色照片圖，1B為脫細胞處理後的蘇木精-伊紅（HE）染色照片圖；
圖2為該發明的脫細胞角膜基質一實施例的脫細胞處理前和脫細胞處理後的透射電鏡照片對比圖，其中，2A為脫細胞處理前的透射電鏡照片圖，2B為脫細胞處理後的透射電鏡照片圖。
權利要求
1.一種脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟：
A、將摘取的動物角膜放入水中，振盪處理，以使上皮層脫落；
B、將水更換為脫細胞試劑，振盪處理，期間，所述脫細胞試劑和水交替使用，以使基質細胞和內皮細胞脫落；
C、加入脫水劑，靜置或振盪處理，得到脫細胞角膜；
D、將所述脫細胞角膜進行削切，得到脫細胞角膜基質，所述脫細胞角膜基質只含有前彈力層和基質層；其中，所述脫細胞試劑含有NaCl和EDTA，所述脫水劑含有甘油。
2.如權利要求1所述的脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在於，所述脫細胞試劑為：濃度為2～5摩爾/升的NaCl溶液與濃度為0.5～5克/升的EDTA溶液的混合液。
3.如權利要求2所述的脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在於，所述脫細胞試劑的pH值為7.0～7.4；所述脫細胞試劑和/或水的溫度為2～37℃。
4.如權利要求1所述的脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在於，所述A步驟的振盪時間為5～10小時，期間，每隔1～2小時更換一次水；所述B步驟的振盪時間為40～70小時，期間，每隔1～2小時交替更換一次脫細胞試劑或水。
5.如權利要求1所述的脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在於，所述脫水劑中甘油的體積比為50～90％。
6.如權利要求1所述的脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在於，在所述C步驟之後、D步驟之前還包括以下步驟：X、使用濃度為2～5克/升碳酸氫鈉溶液清洗所述動物角膜2～10分鐘。
7.如權利要求1所述的脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在於，在所述A步驟之後、B步驟之前還包括以下步驟：Y、將水更換成濃度為0.02～2‰的次氯酸鈉溶液，靜置10～60分鐘。
8.如權利要求1所述的脫細胞角膜基質的製備方法，其特徵在於，在所述D步驟之後，還包括以下步驟：Z、將所述脫細胞角膜基質用鈷-60輻照。
9.一種脫細胞角膜基質，其特徵在於，由權利要求1至8中任一項所述的製備方法製備得到。
10.如權利要求9所述的脫細胞角膜基質，其特徵在於，所述脫細胞角膜基質的厚度為150～550微米，直徑為0.5～1.2毫米。
實施方式
《一種脫細胞角膜基質及其製備方法》在第一實施例中，所述脫細胞角膜基質的製備方法包括以下步驟：
A、將摘取的動物角膜，放入裝有水的試劑瓶中，然後在恆溫振盪器中以200轉/每分鐘的轉速振盪處理5小時（小時），期間，每隔1小時換一次水，以使上皮層脫落。所述動物包括豬、牛、羊等動物，所用的水包括注射水、純水、生理鹽水等。在振盪處理過程中，角膜基質的膠原蛋白吸水蓬鬆，角膜逐漸吸水變厚，所述角膜基質細胞和內皮細胞逐漸破裂，角膜上皮層逐漸脫落。在振盪處理結束時，所述角膜呈飛碟狀，所述角膜上皮層全部脫落。將水更換成濃度為0.02‰的次氯酸鈉溶液進行滅病毒處理，靜置60分鐘後倒去次氯酸鈉溶液，再用水洗去殘留的次氯酸鈉。
B、在裝有所述動物角膜的試劑瓶內加入含有濃度為5摩爾/升的NaCl和5克/升的EDTA的脫細胞試劑，然後在恆溫振盪器中以200轉/每分鐘的轉速振盪處理1小時後，將所述脫細胞試劑替換為所述水在恆溫振盪器中以200轉/每分鐘的轉速振盪處理1小時，如此這兩種溶液交替使用，共振盪處理40小時。
C、加入甘油所占體積比為90％的脫水劑，在25℃溫度下振盪處理30分鐘（分鐘），得到脫細胞角膜。脫細胞處理後的角膜由於吸水，厚度變厚，故使用含有甘油的脫水劑脫去角膜中的水分，能使角膜厚度達到原始厚度。使用濃度為2克/升碳酸氫鈉溶液清洗得到的脫細胞角膜10分鐘。這樣，既可以降低角膜中甘油含量至合理範圍，又可以使角膜中含有一定水分。
D、將所述脫細胞角膜進行削切，得到脫細胞角膜基質，所述脫細胞角膜基質只含有前彈力層和基質層。將得到的所述脫細胞角膜基質用用劑量為5KGy的鈷-60輻照滅菌。
通過脫細胞試劑和水的交替使用，反覆改變組織滲透壓的方法，能逐步去除角膜基質中免疫原細胞成分和可溶性蛋白，從而得到完好的脫細胞角膜基質。此外，通過削切處理，可製備出只含有前彈力層和基質層的脫細胞角膜基質，使得臨床使用前只需醫生根據患者創面大小和深度選擇對應的規格型號，環鑽取得合適的直徑大小的脫細胞角膜基質即可使用。這樣，不僅操作簡單，又能避免污染。
第二實施例中，所述脫細胞角膜基質的製備方法包括以下步驟：
A、將摘取的動物角膜，放入裝有水的試劑瓶中，然後在恆溫振盪器中以150轉/每分鐘的轉速振盪處理10小時（小時），期間，每隔2小時換一次水，以使上皮層脫落。所述動物包括豬、牛、羊等動物，所用的水包括注射水、純水、生理鹽水等。將水更換成濃度為2‰的次氯酸鈉溶液進行滅病毒處理，靜置10分鐘後倒去次氯酸鈉溶液，再用水洗去殘留的次氯酸鈉。
B、在裝有所述動物角膜的試劑瓶內加入含有濃度為2摩爾/升的NaCl和0.5克/升的EDTA的脫細胞試劑，然後在恆溫振盪器中以100轉/每分鐘的轉速振盪處理2小時後，將所述脫細胞試劑替換為所述水在恆溫振盪器中以100轉/每分鐘的轉速振盪處理2小時，如此這兩種溶液交替使用，共振盪處理70小時。
C、加入甘油所占體積比為50％的脫水劑，在2℃溫度下靜置處理60分鐘（分鐘），得到脫細胞角膜。使用濃度為5克/升碳酸氫鈉溶液清洗得到的脫細胞角膜2分鐘。
D、將所述脫細胞角膜進行削切，得到脫細胞角膜基質，所述脫細胞角膜基質只含有前彈力層和基質層。將得到的所述脫細胞角膜基質用用劑量為25KGy的鈷-60輻照滅菌。
第三實施例中，在第二實施例的基礎上，採用以下參數進行實施：所述脫細胞試劑的pH值為7.0；所述脫細胞試劑和/或水的溫度為37℃。
第四實施例中，與第三實施例相比，所述脫細胞試劑的pH值為7.4；所述脫細胞試劑和/或水的溫度為2℃。該發明還提供一種脫細胞角膜基質，在第一實施例中，由前述製備方法製備得到的脫細胞角膜基質厚度為150微米，直徑為0.5毫米。通過削切處理，可製備出只含有角膜前彈力層與基質層的角膜。臨床使用前，無需醫生對材料進行厚度的處理，醫生只需根據患者創面大小和深度選擇對應的規格型號，環鑽取得合適的直徑大小的脫細胞角膜基質即可使用。這樣，不僅操作簡單，又能避免污染。此外，由於該方法製備的所述脫細胞角膜基質表面平整，創面能夠快速癒合。
在第二實施例中，由前述製備方法製備得到的脫細胞角膜基質厚度為550微米，直徑為1.2毫米。圖1至圖2，以豬角膜為實驗對象，採用該發明提供的脫細胞角膜基質的製備方法，得到以下實驗結果：取依據上述製備方法所製得的豬脫細胞角膜基質進行形態學HE染色觀察、超微結構透射電鏡觀察。
結果顯示：圖1中，1A為脫細胞處理前的蘇木精-伊紅（HE）染色照片圖，其中正常角膜具有完整的全層角膜上皮細胞和單層角膜內皮細胞，角膜基質記憶體在大量基質細胞；1B為脫細胞處理後的蘇木精-伊紅（HE）染色照片圖，其中脫細胞處理後，角膜中未觀察到任何完整的細胞，如上皮細胞和內皮層。
圖2中，2A為脫細胞處理前天然豬角膜的透射電鏡照片圖，2B為脫細胞處理後的透射電鏡照片圖，2B顯示脫細胞角膜中膠原纖維排列整齊，與圖2A對比觀察，脫細胞處理後的角膜基質膠原結構與天然角膜膠原結構一致，說明脫細胞過程未對角膜膠原結構造成破壞。
榮譽表彰
2017年12月11日，《一種脫細胞角膜基質及其製備方法》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
