《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》是廣州白雲山漢方現代藥業有限公司於2014年12月30日申請的專利，該專利的申請號為2014108412673，公布號為CN104558020A，授權公布日為2015年4月29日，發明人是許文東、唐順之、袁誠、李繼榮、黃建軍、關偉鍵、蔡鴻飛、楊玉瓊、譚巧君、牟肖男、梁北梅、王小妹。
《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》公開了一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法，步驟包括以蛋黃卵磷脂為原料，經過柱層析以多鹵代烷烴-低碳醇-水所組成的三元混合溶劑進行兩次洗脫，乾燥，得到磷脂醯膽鹼產品。該發明所得產品磷脂醯膽鹼純度在98.0%~99.9% （HPLC法）之間，溶血磷脂醯膽量少於0.5%、膽固醇少於0.2%、游離脂肪酸少於0.2%、甘油三酯少於0.2%，酸值低於1.0、過氧化值低於1.0、甲氧基苯胺值低於5.0，達到進口注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的質量標準。
2018年12月20日，《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》獲得第二十屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法
- 公布號：CN104558020A
- 授權日：2015年4月29日
- 申請號：2014108412673
- 申請日：2014年12月30日
- 申請人：廣州白雲山漢方現代藥業有限公司
- 地址：廣東省廣州市海珠區江南大道中134號
- 發明人：許文東、唐順之、袁誠、李繼榮、黃建軍、關偉鍵、蔡鴻飛、楊玉瓊、譚巧君、牟肖男、梁北梅、王小妹
- Int.Cl.：C07F9/10(2006.01)I
- 代理機構：廣州市深研專利事務所
- 代理人：姜若天
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
磷脂醯膽鹼（phosphatidyl choline，簡稱PC）又稱為卵磷脂，結構上是由膽鹼與磷脂酸兩部分組成的一類磷脂化合物。磷脂醯膽鹼是生物體的重要組分，作為天然的乳化劑及營養補充劑，在食品、化工、醫藥中套用廣泛。在藥品領域中主要用作增溶劑、乳化劑、油脂類的抗氧化劑等，是新型靶向製劑如脂質體和脂微球等製劑的重要輔料。臨床上，磷脂醯膽鹼可作為低水溶性藥物的載體，能提高藥物的生物利用度，降低藥物毒性。注射用磷脂醯膽鹼作為新型脂質體、脂微球製劑的關鍵輔料，其質量標準包括產品的純度、雜質限度、氧化指標等，另外甲氧基苯胺值是過氧化物的再次氧化產物指標，在製劑中有嚴格控制，因此開發注射用磷脂醯膽鹼需要嚴格控制上述關鍵指標。
截至2014年12月，純化磷脂醯膽鹼的方法包括CO2超臨界萃取法、膜分離法、金屬鹽沉澱法、吸附法、柱層析法、溶劑提取法等工藝方法。
金屬鹽沉澱法存在絡合物解析金屬離子過程繁瑣、容易造成污染等缺陷，導致實際套用率低。CO2超臨界萃取法只適合製備混合磷脂，所得產品磷脂醯膽鹼含量普遍偏低。磷脂醯膽鹼與其他磷脂的分子量較接近，膜分離法要得到單一磷脂醯膽鹼仍存在困難，其產品含量偏低不能滿足注射用輔料要求。溶劑提取法是通過磷脂醯膽鹼在兩相溶劑中的溶解度的差異達到富集純化的目的，對理化性質非常相似的各類磷脂雜質的選擇性較差。
吸附法是一種較常用的純化方法，通過選擇不同理化特性的吸附劑對待吸附原料液進行攪拌吸附，達到純化的效果，常見的吸附劑有：三氧化二鋁、矽膠等，該方法只對磷脂醯乙醇胺（PE）、酸值等指標有一定的吸附效果，很難保證含量、溶血磷脂醯膽鹼（LPC）以及膽固醇等關鍵指標符合注射用標準。
矽膠柱層析法是另一種較常用的分離純化方法，固定相與待分離物質的比例、洗脫溶劑種類和比例對柱層析的分離效果與除雜能力有顯著的影響，柱層析方法的溶劑及比例選擇與產品本身的性質以及雜質性質有關，該方法雖常見，但能夠使產品質量在滿足注射用質量標準要求的同時又能符合商業化大生產的方法未見文獻報導。
採用柱層析純化磷脂醯膽鹼的專利較多，其中日本專利JP52083912A、JP52057212A公開以矽膠柱層析，以三氯甲烷-乙醇或三氯甲烷-甲醇為洗脫劑，得到磷脂醯膽鹼含量分別為80％、89％的產品，上述兩篇專利產品的含量均低於98％，不能滿足注射用要求。
中國專利CN103073572A公開了一種經過180℃高溫熱化，丙酮脫油，離心，矽膠吸附過濾等步驟，得到過氧化值0.84、酸值9.06、磷脂醯膽鹼含量為88.6％-92.1％的產品，該專利技術高溫處理磷脂會導致醛酮類氧化物質（甲氧基苯胺值）的產生，且所得產品純度、酸值、脂肪酸等指標均不能符合注射用標準要求。
中國專利CN100500676C公開了以大豆粉末磷脂為原料經過提取，一次氧化鋁層析一次矽膠層析，低碳醇-水洗脫，得到酸值8.7、磷脂醯膽鹼含量為93.4％的產品，該方法所得產品磷脂醯膽鹼含量偏低，酸值、甘油三酯、脂肪酸、甲氧基苯胺值等指標無法有效控制。
中國專利CN102633832A公開了一種以矽膠柱層析，以醇水洗脫得到含有磷脂醯膽鹼含量分別為90％-97.5％的產品方法，該專利方法均無法做到在純化提高含量的同時控制甘油三酯等雜質指標和過氧化值等氧化指標，使產品質量符合注射用輔料要求。
以上報導磷脂醯膽鹼柱層析專利技術方法在甘油三酯、膽固醇、脂肪酸等雜質限度和酸值、過氧化值、甲氧基苯胺值等氧化指標方面均沒法控制，難以將上述技術方法套用於注射用藥用輔料領域。2014年12月之前開發注射用磷脂醯膽鹼的技術領域裡，沒有專門針對控制過氧化值、甲氧基苯胺值等理化指標的方法，磷脂醯膽鹼本身具有高不穩定性，開發該類產品需要過度依賴於起始原料的新鮮度；受技術約束，中國國內注射用蛋黃磷脂醯膽鹼主要依賴進口，且價格昂貴，供貨周期長，導致磷脂醯膽鹼相關產品開發周期長、成本高，不利於市場的普及。
因此，開發以蛋黃卵磷脂為原料，通過柱層析並對三元混合溶劑比例進行控制，經過兩次洗脫，即可以提高產品含量又可以降低膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、酸值、過氧化值、甲氧基苯胺值等關鍵指標，使蛋黃磷脂醯膽鹼符合注射用輔料標準的方法，對開發新型靶向製劑極具意義。
發明內容
專利目的
《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》的目的在於提供一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法。通過柱層析以三元混合溶劑為洗脫劑進行兩次洗脫，一步提高磷脂醯膽鹼含量並且有效控制產品中雜質限度（溶血磷脂醯膽鹼、鞘磷脂、游離脂肪酸、甘油三酯）和氧化指標（酸值、過氧化值、甲氧基苯胺值）。
技術方案
《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》的技術方案：
以蛋黃卵磷脂為原料，加入多鹵代烷烴溶解，經過柱層析以多鹵代烷烴-低碳醇-水所組成的三元混合溶劑進行兩次洗脫，乾燥，得到注射用蛋黃磷脂醯膽鹼。
所用原料是磷脂醯膽鹼含量符合中國藥典2010版二部要求（PC＞72％）的蛋黃卵磷脂。
所用填料包括矽膠、二醇基矽膠。
所用填料與原料的重量比例為1:1～10:1。
所用的多鹵代烷烴包括二氯甲烷、三氯甲烷或二氯乙烷。
所用的低碳醇為無水乙醇、丙醇、異丙醇或正丁醇。
第一次洗脫所用的三元混合溶劑包括多鹵代烷烴，低碳醇和水。其中多鹵代烷烴占混合溶劑的比例為65.5％～89.8％，水占混合溶劑的比例為0.2％～1.5％，其餘為低碳醇。
第二次洗脫所用的三元混合溶劑包括多鹵代烷烴，低碳醇和水。其中多鹵代烷烴占混合溶劑的比例為44.8％～62.3％，水占混合溶劑的比例為1.5％～3.0％，其餘為低碳醇。
方法所述第一次洗脫體積用量（v）與原料重量（w）比為3:1～18:1（升/千克）。
方法所述第二次洗脫體積用量（v）與原料重量（w）比為10:1～60:1（升/千克）。
有益效果
（1）《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》採用三元混合溶劑體系，結合兩次洗脫，就可以保證蛋黃磷脂醯膽鹼含量符合要求的同時達到脫色、除雜（降低溶血磷脂醯膽鹼、膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸含量等雜質限度）、降值（降低酸值、過氧化值、甲氧基苯胺值）的效果。
（2）《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》解決了2014年12月之前同類專利技術所存在的技術瓶頸，從技術層面解決了降低過氧化值、甲氧基苯胺值等理化指標的難題，大大減少蛋黃磷脂醯膽鹼產品對起始原料新鮮程度的過度依賴。
（3）2014年12月之前技術主要是以大豆來源的磷脂為起始原料製備高純度的磷脂醯膽鹼，《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》以蛋黃來源的磷脂為原料製備注射用蛋黃磷脂醯膽鹼，填補了國內該領域的技術空白。
（4）《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》對原料的處理量大，生產操作簡便，可商業化大生產得到符合注射用蛋黃磷脂醯膽鹼標準的合格產品，打破國外壟斷，有利於國內新型靶向製劑在市場上的普及套用。
技術領域
《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》屬於製藥工程技術領域，具體地說，涉及一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法。
權利要求
1.一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法，其特徵是以蛋黃卵磷脂為原料，經過柱層析以多鹵代烷烴-低碳醇-水所組成的三元混合溶劑進行兩次洗脫，乾燥，得到注射用蛋黃磷脂醯膽鹼；第一次洗脫所用的三元混合溶劑為多鹵代烷烴，低碳醇和水；其中多鹵代烷烴占混合溶劑的比例為65.5%~89.8%，水占混合溶劑的比例為0.2%~1.5%，其餘為低碳醇；第二次洗脫所用的三元混合溶劑為多鹵代烷烴、低碳醇和水；其中多鹵代烷烴占混合溶劑的比例為44.8%~62.3%，水占混合溶劑的比例為1.5%~3.0%，其餘為低碳醇；柱層析所用的填料為矽膠或二醇基矽膠；所用填料與原料的重量比例為1:1~10:1；所用的多鹵代烷烴為二氯甲烷、三氯甲烷或二氯乙烷；所用的低碳醇為無水乙醇、丙醇、異丙醇或正丁醇；第一次洗脫體積用量與原料重量比為3:1~18:1，升/千克；第二次洗脫體積用量與原料重量比為10:1~60:1，升/千克。
實施方式
以下實施例所得產品中磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯膽鹼、鞘磷脂、膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸含量以及酸值、過氧化值等關鍵指標均參照進口註冊標準（JF20100002）所述方法進行測定，甲氧基苯胺值按照歐洲藥典8.0版2.5.36方法測定。
- 實施例1：
取蛋黃卵磷脂1千克，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填裝10千克矽膠進行柱層析，第一次以洗脫劑（三氯甲烷77.8％、乙醇21.8％、水0.4％）洗脫18升，第二次再以洗脫劑（二氯甲烷44.8％、乙醇53.7％、水1.5％）洗脫60升收集洗脫液，經過真空濃縮，冷凍乾燥得到磷脂醯膽鹼產品，PC轉移率為75.5％，磷脂醯膽鹼純度為99.5％，溶血磷脂醯膽鹼未檢出，鞘磷脂0.3％，酸值為0.8，過氧化值未檢出，甲氧基苯胺值為3.8，甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量均符合規定。
- 實施例2：
取蛋黃卵磷脂1千克，加入二氯乙烷溶解配成原料液，填裝7千克矽膠進行柱層析，第一次以洗脫劑（二氯乙烷84.0％、異丙醇14.5％、水1.5％）洗脫18升，第二次再以洗脫劑（三氯甲烷62.3％、丙醇34.7、水3.0％）洗脫55升收集洗脫液，經過真空濃縮，冷凍乾燥得到磷脂醯膽鹼產品，PC轉移率為80.7％，磷脂醯膽鹼純度為99.1％，溶血磷脂醯膽鹼未檢出，鞘磷脂0.5％，酸值為0.3，過氧化值未檢出，甲氧基苯胺值為2.5，甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量均符合規定。
- 實施例3：
取蛋黃卵磷脂5千克，加入二氯甲烷溶解配成原料液，填裝25千克二醇基矽膠進行柱層析，第一次以洗脫劑（二氯甲烷89.8％、乙醇10％、水0.2％）洗脫75升，第二次再以洗脫劑（三氯甲烷44.8％、正丁醇52.7％、水2.5％）洗脫200升收集洗脫液，經過真空濃縮，冷凍乾燥得到磷脂醯膽鹼產品，PC轉移率為82.1％，磷脂醯膽鹼純度為98.9％，溶血磷脂醯膽鹼含量未檢出，鞘磷脂0.3％，酸值為0.9，過氧化值未檢出，甲氧基苯胺值為4.2，甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量均符合規定。
- 實施例4：
取蛋黃卵磷脂10千克，加入二氯乙烷溶解配成原料液，填裝50千克矽膠進行柱層析，第一次以洗脫劑（二氯乙烷67.0％、乙醇32.0％、水1.0％）洗脫120升，第二次再以洗脫劑（二氯乙烷53.4％、丙醇45％、水1.6％）洗脫450升收集洗脫液，經過真空濃縮，冷凍乾燥得到磷脂醯膽鹼產品，PC轉移率為85.8％，磷脂醯膽鹼純度為98.5％，溶血磷脂醯膽鹼含量為0.5％，鞘磷脂0.7％，酸值為1.0，過氧化值未檢出，甲氧基苯胺值為2.0，甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量均符合規定。
- 實施例5：
取蛋黃卵磷脂10千克，加入二氯乙烷溶解配成原料液，填裝30千克二醇基矽膠進行柱層析，第一次以洗脫劑（二氯乙烷75.5％、乙醇33％、水1.5％）洗脫100升，第二次再以洗脫劑（二氯甲烷48.0％、丙醇50.0％、水2.0％）洗脫450升收集洗脫液，經過真空濃縮，冷凍乾燥得到磷脂醯膽鹼產品，PC轉移率為79.4％，磷脂醯膽鹼純度為99.0％，溶血磷脂醯膽鹼含量為0.4％，鞘磷脂0.3％，酸值為1.0，過氧化值未檢出，甲氧基苯胺值為2.7，甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量均符合規定。
- 實施例6：
取蛋黃卵磷脂20千克，加入二氯乙烷溶解配成原料液，填裝40千克矽膠進行柱層析，第一次以洗脫劑（二氯乙烷82.4％、正丁醇16.9％、水0.7％）洗脫160升，第二次再以洗脫劑（二氯乙烷62.0％、乙醇36.4％、水1.6％）洗脫440升收集洗脫液，經過真空濃縮，冷凍乾燥得到磷脂醯膽鹼產品，PC轉移率為77.5％，磷脂醯膽鹼純度為98.2％，溶血磷脂醯膽鹼含量為0.3％，鞘磷脂0.8％，酸值為0.5，過氧化值未檢出，甲氧基苯胺值為3.1，甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量均符合規定。
- 實施例7：
取蛋黃卵磷脂50千克，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填裝50千克矽膠進行柱層析，第一次以洗脫劑（三氯甲烷70.0％、丙醇28.5％、水1.5％）洗脫150升，第二次再以洗脫劑（二氯乙烷53.0％、異丙醇45.0％、水2.0％）洗脫500升收集洗脫液，經過真空濃縮，冷凍乾燥得到磷脂醯膽鹼產品，PC轉移率為83.3％，磷脂醯膽鹼純度為98.7％，溶血磷脂醯膽鹼含量為0.5％，鞘磷脂0.3％，酸值為0.8，過氧化值未檢出，甲氧基苯胺值為4.0，甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量均符合規定。
- 實施例8：
取蛋黃卵磷脂50千克，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填裝400千克矽膠進行柱層析，第一次以洗脫劑（三氯甲烷67.0％、乙醇32.0％、水1.0％）洗脫900升，第二次再以洗脫劑（三氯甲烷48.0％、乙醇50.0％、水2.0％）洗脫1500升收集洗脫液溶劑經過真空濃縮，冷凍乾燥得到磷脂醯膽鹼產品，PC轉移率為79.6％，磷脂醯膽鹼純度為99.4％，溶血磷脂醯膽鹼含量為0.2％，鞘磷脂0.2％，酸值為0.6，過氧化值未檢出，對甲氧基苯胺值為2.8，甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量均符合規定。
- 實施例9：
取蛋黃卵磷脂100千克，加入二氯甲烷溶解配成原料液，填裝100千克二醇基矽膠進行柱層析，第一次以洗脫劑（二氯甲烷68.0％、丙醇31.5％、水0.5％）洗脫300升，第二次再以洗脫劑（二氯乙烷44.8％、正丁醇53.0％、水2.2％）洗脫1800升收集洗脫液，經過真空濃縮，冷凍乾燥得到磷脂醯膽鹼產品，PC轉移率為82.1％，磷脂醯膽鹼純度為98.0％，溶血磷脂醯膽鹼含量為0.3％，鞘磷脂0.9％，酸值為1.0，過氧化值未檢出，甲氧基苯胺值為2.3，甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量均符合規定。
- 實施例10：
取蛋黃卵磷脂100千克，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填裝400千克二醇基矽膠進行柱層析，第一次以洗脫劑（二氯乙烷73.0％、異丙醇25.5％、水1.5％）洗脫1200升，第二次再以洗脫劑（二氯乙烷58.7％、異丙醇39.3％、水2.0％）洗脫3200升收集洗脫液，經過真空濃縮，冷凍乾燥得到磷脂醯膽鹼產品，PC轉移率為88.6％，磷脂醯膽鹼純度為99.0％，溶血磷脂醯膽鹼含量為0.1％，鞘磷脂0.4％，酸值為0.5，過氧化值未檢出，甲氧基苯胺值為1.0，甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量均符合規定。
- 實施例11：
取蛋黃卵磷脂150千克，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填裝600千克二醇基矽膠進行柱層析，第一次以洗脫劑（三氯甲烷75.0％、正丁醇23.5％、水1.5％）洗脫1800升，第二次再以洗脫劑（三氯甲烷50.0％、乙醇47.0％、水3.0％）洗脫4200升收集洗脫液，經過真空濃縮，冷凍乾燥得到磷脂醯膽鹼產品，PC轉移率為89.9％，磷脂醯膽鹼純度為99.0％，溶血磷脂醯膽鹼含量為0.1％，鞘磷脂0.6％，酸值為0.5，過氧化值未檢出，甲氧基苯胺值為4.3，甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量均符合規定。
- 實施例12：
取蛋黃卵磷脂200千克，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填裝1200千克矽膠進行柱層析，第一次以洗脫劑（三氯甲烷85.0％、丙醇14.0％、水1.0％）洗脫3600升，第二次再以洗脫劑（三氯甲烷57.0％、丙醇41.0％、水2.0％）洗脫7200升收集洗脫液溶劑經過真空濃縮，冷凍乾燥得到磷脂醯膽鹼產品，PC轉移率為81.2％，磷脂醯膽鹼純度為99.5％，溶血磷脂醯膽鹼含量為未檢出，鞘磷脂0.2％，酸值為0.4，過氧化值未檢出，對甲氧基苯胺值為3.5，甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量均符合規定。
由於已有專利技術所得到產品的個別指標在注射用標準範圍內，所以根據已有專利技術最佳效果實施例方法製備產品，並按照進口標準（JF20100002）方法測定磷脂醯膽鹼含量（PC）、溶血磷脂醯膽鹼（LPC）、鞘磷脂（SM），過氧化值、酸值等關鍵指標，甲氧基苯胺值按照歐洲藥典8.0版2.5.36方法測定。並與《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》產品的檢測數據進行對比，結果如下所示：
按中國專利CN103073572A實施例1所述方法實施，以蛋黃來源的磷脂為起始原料，得到蛋黃磷脂醯膽鹼樣品1。
按中國專利CN100500676C實施例1所述方法實施，以蛋黃來源的磷脂為起始原料，得到蛋黃磷脂醯膽鹼樣品2。
按中國專利CN102633832A實施例4所述方法實施，以蛋黃來源的磷脂為起始原料，得到蛋黃磷脂醯膽鹼樣品3。
根據上述專利實施例製備所得樣品，按質量標準檢測關鍵指標，結果如表1所示。
表1
結果顯示，使用2014年12月之前專利技術報導的鹵代烷烴-甲醇或醇水洗脫矽膠柱的方法，並不能將酸值、過氧化值、甲氧基苯胺值等關鍵指標降低到注射用要求的水平。《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》選用矽膠、二醇基矽膠等5種填料，對溶劑體系、洗脫方式、洗脫條件、填料用量等因素進行了大量的實驗探索，加入多鹵代烷烴與調節洗脫劑中水的含量後通過兩次洗脫就能得到低雜質（溶血磷脂醯膽量少於0.5％、膽固醇少於0.2％、游離脂肪酸少於0.2％、甘油三酯少於0.2％）、低氧化指標（酸值低於1.0、過氧化值低於1.0、甲氧基苯胺值低於5.0）的產品，達到2014年12月之前專利技術所不能達到的效果。
榮譽表彰
2018年12月20日，《一種注射用蛋黃磷脂醯膽鹼的製備方法》獲得第二十屆中國專利優秀獎。
