一種治療腫瘤的小牛脾提取物:專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,權利要求,實施

《一種治療腫瘤的小牛脾提取物》是吉林敖東洮南藥業股份有限公司於2010年8月19日申請的專利，該專利的公布號為CN102210702A，授權公布日為2011年10月12日，發明人是楊振軍、鄒兆鵬、王銀葉、王國棟。

《一種治療腫瘤的小牛脾提取物》其中小牛脾提取物中含5-15重量份多肽、0.4-1重量份核糖。該提取物製劑可明顯抑制腫瘤，顯著拮抗化療藥環磷醯胺所致小鼠白細胞減少、逆轉環磷醯胺對骨髓細胞的抑制，並且該提取物能夠治療急性早幼粒細胞白血病。

2019年10月，《一種治療腫瘤的小牛脾提取物》獲得第三屆吉林省專利獎優秀獎。

基本介紹

中文名：一種治療腫瘤的小牛脾提取物
申請人：吉林敖東洮南藥業股份有限公司
申請日：2010年8月19日
申請號：201110134051X
公布號：CN102210702A
公布日：2011年10月12日
發明人：楊振軍、鄒兆鵬、王銀葉、王國棟
地址：吉林省白城市洮南市團結東路16號
Int.Cl.：A61K35/28(2006.01)I、A61K9/08(2006.01)I、A61P35/00(2006.01)I、A61P35/02(2006.01)I等
代理機構：北京太兆天元智慧財產權代理有限責任公司
代理人：劉偉
類別：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,權利要求,實施方式,實驗案例,實施案例,榮譽表彰,

專利背景

癌症發病率和死亡率逐年上升，嚴重威脅人類健康，已成為人類死亡的主要原因之一。西醫治療多以手術、放療、化療為主，但是套用化療或放療，往往引起噁心，食欲不振，血象變化，機體免疫功能損害等毒副作用，在癌細胞受到抑制或部分殺滅的同時，人體正常組織細胞也相應的受到極大地摧殘和傷害，因此導致許多患者無法堅持完成放、化療療程，失去有效治療機會。

該發明提供的小牛脾提取物注射液，是由健康乳牛（出生24小時以內）脾臟為原料提取而成的無菌水溶液。其既能抑制腫瘤細胞，同時可以拮抗化療藥的副作用，提高患者體質，使患者能堅持完成放、化療療程，延長生存期。

發明內容

專利目的

《一種治療腫瘤的小牛脾提取物》一個目的在於提供一種治療腫瘤的小牛脾提取物；該發明的另一個目的在於提供小牛脾提取物在製備治療急性早幼粒細胞白血病藥物中的套用。

技術方案

《一種治療腫瘤的小牛脾提取物》目的在於提供一種治療腫瘤的小牛脾提取物注射液，其中2～6體積份小牛脾提取物注射液中含5-15重量份多肽、0.4-1重量份核糖；所述小牛脾提取物注射液是由如下方法製備：領取乳牛的脾臟（出生24小時以內），除去掉結締組織和脂肪，用0.9％氯化鈉溶液清洗，加入1-5倍量的生理鹽水進行勻漿1～5次，膠體磨粒度為2～8微米；將勻漿液-10℃～-30℃深凍，達到完全凍結後，取出放入20℃～50℃以下水浴中解凍，完全融化後繼續-10℃～-30℃條件下深凍，如此反覆進行三次；將凍融後的藥液60℃～100℃保溫30-40分鐘，速降溫至10℃～20℃；將上述溶液離心，離心速度為3000-4000轉/分，溫度0～10℃以下，離心15-30分鐘，收集上清液；分別用100000～50000道爾頓、10000～9000道爾頓、8000～5000道爾頓的膜超濾；0.20微米濾芯無菌過濾分裝，即得注射液。所述重量份與體積份的關係為毫克/毫升的關係。上述治療腫瘤的小牛脾提取物注射液，其中2.5體積份小牛脾提取物注射液中優選含6.25重量份多肽、0.475重量份核糖。上述治療腫瘤的小牛脾提取物注射液，其中2.5體積份小牛脾提取物注射液中優選含10.5重量份多肽、0.95重量份核糖。上述治療腫瘤的小牛脾提取物注射液，其中2.5體積份小牛脾提取物注射液中優選含9重量份多肽、0.6重量份核糖。

該發明目的在於提供一種治療腫瘤的製劑，該製劑由臨床日用劑量的小牛脾提取物製劑和臨床日用劑量的環磷醯胺製劑組成，其中小牛脾提取物製劑中多肽與核糖的重量比為：5-15:0.4-1。上述治療腫瘤的製劑，該製劑由臨床日用劑量的小牛脾提取物製劑和臨床日用劑量的環磷醯胺製劑組成，其中小牛脾提取物製劑中多肽與核糖的重量比為：6.25:0.475。上述治療腫瘤的製劑，該製劑由臨床日用劑量的小牛脾提取物製劑和臨床日用劑量的環磷醯胺製劑組成，其中小牛脾提取物製劑中多肽與核糖的重量比為：9:0.6。上述治療腫瘤的製劑，該製劑由臨床日用劑量的小牛脾提取物製劑和臨床日用劑量的環磷醯胺製劑組成，其中小牛脾提取物製劑中多肽與核糖的重量比為：10.5:0.95。

所述小牛脾提取物製劑優選注射製劑。小牛脾提取物及其注射製劑在製備治療急性早幼粒細胞白血病藥物中的套用。小牛脾提取物及其注射製劑在製備拮抗環磷醯胺副作用中的套用。該發明提取一種抗腫瘤用藥劑盒，由置於包裝單位中的許多獨立包裝且各自可取出的7個日劑量單位組成，其中第一個日劑量單位包含4-12克環磷醯胺注射劑和4-12毫升小牛脾提取物注射液，其餘六個日劑量單位包含小牛脾提取物注射液4-12毫升。上述小牛脾提取物可以通過現有技術製備，小牛脾提取物注射製劑優選如下方法製備：

領取乳牛的脾臟（出生24小時以內），除去掉結締組織和脂肪，用0.9％氯化鈉溶液清洗，加入1-5倍量的生理鹽水進行勻漿1～5次，膠體磨粒度為2～8微米；將勻漿液-10℃～-30℃深凍，達到完全凍結後，取出放入20℃～50℃以下水浴中解凍，完全融化後繼續-10℃～-30℃條件下深凍，如此反覆進行三次；將凍融後的藥液60℃～100℃保溫30-40分鐘，速降溫至10℃～20℃；將上述溶液離心，離心速度為3000-4000轉/分，溫度0～10℃以下，離心15-30分鐘，收集上清液；分別用100000～50000道爾頓、10000～9000道爾頓、8000～5000道爾頓的膜超濾；0.20微米濾芯無菌過濾分裝，即得注射液。小牛脾提取物製劑可顯著拮抗化療藥環磷醯胺（CTX）所致小鼠白細胞減少；可逆轉環磷醯胺對骨髓細胞的抑制，刺激骨髓細胞的增殖，使骨髓細胞的數量增加；小牛脾提取物均可以顯著抑制HL60細胞的增殖，用於治療急性早幼粒細胞白血病。

權利要求

1.《一種治療腫瘤的小牛脾提取物》其特徵在於小牛脾提取物中多肽與核糖的重量比為：5-15:0.4-1。

2.如權利要求1所述的小牛脾提取物，其特徵在於小牛脾提取物中多肽與核糖的重量比為：6.2:0.475。

3.一種治療腫瘤的藥物組合物製劑，其特徵在於該製劑由臨床日用劑量的小牛脾提取物製劑和臨床日用劑量的環磷醯胺製劑組成，其中小牛脾提取物製劑中多肽與核糖的重量比為：5-15:0.4-1。

4.如權利要求3所述的藥物組合物製劑，其特徵在於該製劑由臨床日用劑量的小牛脾提取物製劑和臨床日用劑量的環磷醯胺製劑組成，其中小牛脾提取物製劑中多肽與核糖的重量比為：6.2:0.475。

5.如權利要求1或2所述的小牛脾提取物的製備方法，其特徵在於：取乳牛的脾臟，用0.9％氯化鈉溶液清洗，加入1-5倍量的生理鹽水進行勻漿1～5次，膠體磨粒度為2～8微米；將勻漿液-10℃～-30℃深凍，達到完全凍結後，取出放入20℃～50℃以下水浴中解凍，完全融化後繼續-10℃～-30℃條件下深凍，如此反覆進行三次；將凍融後的藥液60℃～100℃保溫30-40分鐘，速降溫至10℃～20℃；將上述溶液離心，離心速度為3000-4000轉/分，溫度0～10℃以下，離心15-30分鐘，收集上清液；分別用100000～50000道爾頓、10000～9000道爾頓、8000～5000道爾頓的膜超濾。

6.如權利要求3或4所述的藥物組合物製劑，其特徵在於該製劑中小牛脾提取物由如下方法製備：取乳牛的脾臟，用0.9％氯化鈉溶液清洗，加入1-5倍量的生理鹽水進行勻漿1～5次，膠體磨粒度為2～8微米；將勻漿液-10℃～-30℃深凍，達到完全凍結後，取出放入20℃～50℃以下水浴中解凍，完全融化後繼續-10℃～-30℃條件下深凍，如此反覆進行三次；將凍融後的藥液60℃～100℃保溫30-40分鐘，速降溫至10℃～20℃；將上述溶液離心，離心速度為3000-4000轉/分，溫度0～10℃以下，離心15-30分鐘，收集上清液；分別用100000～50000道爾頓、10000～9000道爾頓、8000～5000道爾頓的膜超濾。

7.如權利要求1或2所述的小牛脾提取物在製備治療急性早幼粒細胞白血病藥物中的套用。

8.如權利要求1或2所述的小牛脾提取物在製備拮抗環磷醯胺副作用藥物中的套用。

9.如權利要求8所述的套用，其特徵在於拮抗環磷醯胺所致白細胞減少、骨髓抑制的副作用。

10.一種抗腫瘤用藥劑盒，其特徵在於由置於包裝單位中的許多獨立包裝且各自可取出的7個日劑量單位組成，其中第一個日劑量單位包含4-12克環磷醯胺注射劑和4-12毫升小牛脾提取物注射液，其餘六個日劑量單位僅包含小牛脾提取物注射液4-12毫升。

實施方式

實驗案例

實驗例1拮抗環磷醯胺副作用研究

1.小牛脾提取物注射液對化療藥環磷醯胺（CTX）所致小鼠白細胞減少的作用

1.1摘要

ICR小鼠腹腔注射小牛脾提取物注射液9天。第7天開始給予CTX，連續3天以建立白細胞減少症動物模型，末次給CTX後24小時眼眶取血，通過血常規分析評價小牛脾提取物注射液對白細胞數量的影響。結果表明：低劑量（2.5毫升/千克）和中劑量（5毫升/千克）的小牛脾提取物注射液有升高白細胞的趨勢，但與模型相比無顯著性差異，高劑量（10毫升/千克）小牛脾提取物注射液可以顯著升高白細胞數量。

1.2實驗材料

（1）實驗動物：18-22克的ICR小鼠60隻，雌雄各半。動物生產合格證號：scxk京2006-0008

（2）實驗藥物：

a.小牛脾提取物注射液（實施例1方法製備）：吉林敖東洮南藥業股份有限公司提供，產品批號：20090505135，為淡黃色澄明液體。有效成分含量：2.5毫克多肽/毫升，190微克核糖/毫升。臨用時用滅菌生理鹽水稀釋。

b.環磷醯胺（CTX）：江蘇恆瑞醫藥股份有限公司生產，產品批號09081521，為白色粉末。臨用前用滅菌生理鹽水配製，需現用現配。

c.重組人粒細胞刺激因子注射液（rhG-CSF）：華北製藥金坦生物技術股份有限公司生產，產品批號：200909Y22，為無色透明液體。臨用時用用滅菌生理鹽水稀釋。

（3）實驗儀器：血液分析儀，型號MEK-6318K，日本光電工業株式會社生產。

1.3實驗方法與步驟

ICR小鼠（18-22克）60隻，雌雄各半，動物生產合格證號：scxk京2006-0008。購自北京大學醫學部動物科學部，隨機分成6組：正常對照組、模型組、陽性藥rhG-CSF（40微克/千克）組、小牛脾提取物低（2.5毫升/千克，相當於6.25毫克多肽/千克，475微克核糖/千克）、中（5.0毫升/千克，相當於12.5毫克多肽/千克，950微克核糖/千克）、高劑量組（10.0毫升/千克，相當於25毫克多肽/千克，1900微克核糖/千克）。

小鼠給連續予小牛脾提取物注射液9天，2次/天。第7天開始小牛脾提取物注射液減為1次/天，同時給予CTX80毫克/千克，連續3天以製備模型，末次給CTX後24小時眼眶取血，測定白細胞數量。

1.4實驗結果

結果顯示：模型組動物的白細胞數明顯低於正常對照組，表明模型成功。小牛脾提取物注射液高劑量組的白細胞數量明顯高於模型組，說明該劑量下小牛脾提取物注射液可以抑制白細胞數下降，與陽性對照GM-CSF組藥效相當。中劑量有升高白細胞數量的趨勢，但模型組相比無顯著性差異，低劑量無效（見表1）。同時分析白細胞分類計數結果後，發現小牛脾提取物高劑量組和GM-CSF組的淋巴細胞數量均較模型組有顯著性升高（見表2）。說明小牛脾提取物注射液高劑量和GM-CSF主要升高白細胞中的淋巴細胞數量。提示小牛脾提取物注射液可以提高小鼠機體免疫力。

表1小牛脾提取物對環磷醯胺誘導的白細胞減少症的影響

組別	劑量（毫升/千克）	淋巴細胞數（10/升）
正常對照	一	6.34±1.98
模型	一	0.44±0.89^^
rhG-CSF	40微克/千克	2.56±0.62**
小牛脾提取物	2.5	0.95±0.90
	5	1.03±1.24
	10	2.19±0.60**

正常組比較：^^P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

表2小牛脾提取物對環磷醯胺誘導的淋巴細胞減少的影響

組別	劑量（毫升/千克）	白細胞數（10/升）	淋巴細胞數（10/升）
正常對照	一	9.27±1.80	6.34±1.98
模型	一	2.47±0.36"	0.44±0.89^^
rhG-CSF	40微克/千克	3.48±0.71*	2.56±0.62**
小牛脾提取物	2.5	2.24±0.35	0.95±0.90
	5	2.66±0.61	1.03±1.24
	10	3.47±0.64*	2.19±0.60**

與正常組比較：^^P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

2.小鼠血清中GM-CSF含量測定

2.1摘要

ICR小鼠腹腔注射小牛脾提取物注射液9天。第7天開始給予CTX，連續3天以建立白細胞減少症動物模型，末次給CTX後24小時眼眶取血，測定血樣中GM-CSF的含量，評價小牛脾提取物注射液對機體生成GM-CSF的影響，以反映骨髓造血系統的功能。結果表明：模型組中的GM-CSF含量較正常組顯著升高，提示化療藥引起骨髓抑制，反饋性刺激機體生成過量的GM-CSF。小牛脾提取物顯著減少GM-CSF含量，使之接近正常組。表明提取物改善了骨髓細胞功能，減輕了骨髓抑制對GM-CSF的反饋性刺激。

2.2實驗材料

（1）測定試劑盒：小鼠GM-CSFElisa檢測試劑盒，美國RB公司產品產品批；

（2）血清樣品：末次給予環磷醯胺24小時後摘眼球取血，離心（3000轉/分鐘，10分鐘）所得血清，-20℃凍存備用。

2.3實驗儀器

550型酶標儀，美國BIO-RAD產品；MCO-15AC二氧化碳培養箱，日本SANYO產品

2.4實驗方法與結果

小鼠連續給予小牛脾提取物注射液9天，2次/天。第7天開始小牛脾提取物注射液減為1次/天，同時給予CTX80毫克/千克，連續3天以製備模型，末次給CTX後24小時眼眶取血，按試劑盒步驟測定血樣中GM-CSF的含量。結果顯示：模型組中的GM-CSF含量較正常組顯著升高，提示因骨髓抑制反饋性刺激機體生成過量的GM-CSF。小牛脾提取物顯著減少GM-CSF含量，使之接近正常組（見表3）。表明提取物改善了骨髓細胞功能，減輕了骨髓抑制對GM-CSF的反饋性刺激。

表3小牛脾提取物對小鼠血清中GM-CSF含量的影響

組別	劑量（毫升/千克）	GM-CSF（皮克/毫升）
正常對照	一	79.30±7.94
模型	一	255.64±15.32^^
rhG-CSF	40微克/千克	95.25±52.83**
小牛脾提取物	2.5	64.75±6.37**
	5	74.67±14.34**
	10	86.16±21.66**

與正常組比較：^^P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

3.小牛脾提取物注射液對骨髓細胞體外增殖的作用

3.1摘要

無菌條件下取白細胞減少症小鼠的股骨骨髓，用10％RPMI1640培養基製備成細胞懸液，用MTT法測定小牛脾提取物注射液在體外對骨髓細胞增殖的影響，以評價小牛脾提取物注射液是否通過刺激骨髓細胞的增殖來升高白細胞數量。結果表明：小牛脾提取物注射液各個濃度組的OD值與生理鹽水組相比均顯著升高。表明小牛脾提取物注射液在體外可逆轉環磷醯胺對骨髓細胞的抑制，刺激骨髓細胞的增殖，使骨髓細胞的數量增加。

3.2實驗材料

（1）實驗動物：18-22克的ICR小鼠4隻，雄性。生產合格證號：scxk京2006-0008

（2）實驗藥物：

a.小牛脾提取物注射液（實施例1方法製備）：吉林敖東洮南藥業股份有限公司提供，產品批號：20090505135，為淡黃色澄明液體。臨用時用滅菌生理鹽水稀釋；

b.環磷醯胺（CTX）：江蘇恆瑞醫藥股份有限公司生產，產品批號09081521，為白色粉末。臨用前用滅菌生理鹽水配製，需現用現配；

（3）實驗儀器：550型酶標儀，美國BIO-RAD產品；3K15台式離板機，Sigma產品；AnkeTDL-40B離心機，上海安亭科學儀器廠產品。

（4）實驗試劑：RPMI1640培養基為美國GIBCOBRL公司產品，噻唑蘭（MTT）為美國GIBCOBRL公司產品，PAA實驗室胎牛血清，二甲基亞碸為天津化工廠產品。

3.3實驗方法

連續3天給予小鼠腹腔注射環磷醯胺80毫克/千克以製備骨髓抑制模型，末次給藥24小時後無菌取小鼠雙側股骨，用6號針頭插入股骨，連線已吸入5毫升不完全RPMI-1640培養基的注射器用於沖取骨髓細胞，將細胞沖入燒杯中，連續沖洗三次，總量為8毫升，將衝出的骨髓細胞於4號半針頭過濾以製成單細胞懸液，然後離心（1000轉/分鐘×10分鐘），棄上清，用含10％FBS的RPMI-1640培養基製備成5×10/毫升的細胞懸液。於96孔板中每孔加入細胞懸液100微升，設為五組，每組6個復孔，分組情況為：

a.生理鹽水組：每孔加入無菌生理鹽水100微升；

b.rhG-CSF組：每孔加入濃度為2微克/毫升的G-CSF溶液100微升，rhG-CSF終濃度為1微克/毫升；

c.小牛脾提取物注射液高劑量組：每孔加入注射液100微升，終濃度為500微升/毫升；

d.小牛脾提取物注射液中劑量組：每孔加入用無菌生理鹽水稀釋4倍的注射液100微升，終濃度為125微升/毫升；

e.小牛脾提取物注射液低劑量組：每孔加入用無菌生理鹽水稀釋16倍的注射液100微升，終濃度為31.2微升/毫升。

然後置96孔板於5％CO₂，37℃飽和濕度培養箱中培養，24小時後每孔加入0.5％（5毫克/毫升）噻唑藍（MTT）20微升，繼續反應4小時，1000轉/分鐘離心15分鐘，棄上清，每孔加入二甲基亞碸（DMSO）200微升，充分混勻後靜置數分鐘，置酶標儀於570納米處測定吸光度（OD）值，以代表骨髓細胞的數量。

3.4實驗結果

小牛脾提取物注射液各個濃度組的OD值與生理鹽水組相比均顯著升高（見表4），表明小牛脾提取物注射液在體外可逆轉環磷醯胺對骨髓細胞的抑制，刺激骨髓細胞的增殖，使骨髓細胞的數量增加。

表4小牛脾提取物對骨髓細胞體外增殖的影響

組別	濃度（微升/毫升）	OD_570納米
生理鹽水	一	0.04±0.01
rhG-CSF	1微克/千克	0.47±0.25*
小牛脾提取物	31.2	0.43±0.11*
	125	0.56±0.31**
	500	0.72±0.27**

與生理鹽水組相比：*P＜0.05；**P＜0.01

實驗例2小牛脾提取物注射液治療急性早幼粒細胞白血病的研究

1.小牛脾提取物注射液對HL60細胞生長的影響

1.1摘要

將HL60細胞在含有不同濃度的小牛脾提取物的培養液中培養不同的時間，用MTT法測定其在570納米處的吸光度以評價細胞的增殖程度。結果表明：與生理鹽水組相比，各個濃度的小牛脾提取物均可以顯著抑制HL60細胞的增殖，並隨時間延長作用增強。

1.2實驗材料

（1）細胞系：HL60細胞，為急性早幼粒細胞白血病細胞系

（2）實驗藥物：小牛脾提取物注射液（實施例1方法製備）：吉林敖東洮南藥業股份有限公司提供，產品批號：20100101133，為淡黃色澄明液體，臨用前用滅菌生理鹽水稀釋。

（3）實驗儀器：550型酶標儀，美國BIO-RAD產品；3K15台式離板機，Sigma產品；AnkeTDL-40B離心機，上海安亭科學儀器廠；MCO-15AC二氧化塘培養箱，日本SANYO產品；DL-CJ-1N高性能無菌實驗台哈爾濱東聯電子技術開發有限公司北京分公司產品；HH-W420數顯三用恆溫水浴箱，江蘇省金壇市榮華儀器製造有限公司

（4）實驗試劑：RPMI1640培養基：美國GIBCO產品；噻唑蘭（MTT）：美國GIBCO產品；胎牛血清：PAA產品；DMSO：天津化工廠產品。

1.3實驗方法

（1）配製RPMI1640高糖培養基：精確稱取250毫克葡萄糖，用10毫升的10％FBSRPMI1640培養基溶解，然後用0.22微米濾膜過濾於一個100毫升的玻璃瓶中，再補加90毫升的10％FBS1640培養基即可配製成葡萄糖濃度達4.5克/升的高糖培養基，僅用於實驗，以刺激HL60細胞的糖酵解。平時培養仍使用含糖量正常的10％FBSRPMI1640培養基（下同）；

（2）收集處於對數生長期，狀態良好的HL60細胞，離心（4℃，1000轉×8分鐘），然後用高糖培養基重懸，計數，然後稀釋至2×10/毫升；

（3）加入100微升細胞懸液至96孔板，分為生理鹽水組、小牛脾提取物注射液高、中、低濃度組。每組4個復孔，然後分別加入生理鹽水和不同濃度的小牛脾提取物各100微升至對應的孔中，使小牛脾提取物的終濃度分別達到：0，31.2，125和500微升/毫升。振搖孔板數次以使細胞混勻，然後放入CO₂培養箱（5％CO₂，37℃）中培養，分別在開始培養後2小時，4小時，8小時三個時間點各取出一塊96孔板，每孔加入0.5％（5毫克/毫升）MTT20微升，繼續培養4小時，使用離板機離心（1000轉×15分鐘），棄上清，每孔加入DMSO200微升，充分混勻後靜置數分鐘，置酶標儀於570納米處測定吸光度，以反映HL60細胞的生長情況。

1.4實驗結果

統計結果表明：與各時間點生理鹽水對照組相比，各個濃度的小牛脾提取物均可以顯著抑制HL60細胞的增殖，並隨時間延長作用增強（見表5）。

表5小牛脾提取物對HL60細胞體外增殖的影響

組別	濃度（微升/毫升）	OD_570納米
組別	濃度（微升/毫升）	2小時	4小時	8小時
生理鹽水	500	2.07±0.38	1.96±0.38	1.98±0.20
小牛脾提取物	31.2	1.67±0.13*	1.30±0.05**	1.42±0.05**
	125	0.62±0.14**	0.38±0.04**	0.25±0.06**
	500	0.48±0.05**	0.17±0.03**	0.16±0.04**

與生理鹽水組相比：*P＜0.05，**P＜0.01

2.小牛脾提取物注射液對HL60細胞乳酸生成的作用研究

2.1摘要

將HL60細胞與不同濃度的小牛脾提取物共培養8小時，然後離心取上清，脫蛋白後測定上清中乳酸的含量。結果表明：與生理鹽水組相比，31.2，125和500微升/毫升三個濃度的小牛脾提取物注射液均可以顯著的抑制HL60細胞產生乳酸，尤其是較高的兩個濃度。

2.2實驗材料

（1）細胞系：HL60細胞

2.3實驗儀器

UV-1100型紫外可見分光光度計，北京普瑞分析儀器公司產品；AnkeTGL-16G-A高速離心機，上海安亭科學儀器廠；MCO-15AC二氧化塘培養箱，日本SANYO產品；DL-CJ-1N高性能無菌實驗台，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司北京分公司產品；HH-W420數顯三用恆溫水浴箱，江蘇省金壇市榮華儀器製造有限公司。

2.4實驗試劑

乳酸檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所產品，批號：20100324；70.0％高氯酸：分析純，天津市鑫源化工有限公司產品；氯化鈉：分析純，北京北化精細化學品有限責任公司；RPMI1640培養基：美國GIBCO產品；胎牛血清：PAA產品；G250考馬斯亮藍：北京鼎國生物技術有限公司產品

2.5實驗方法

（1）收集處於對數生長期、狀態良好的HL60細胞，離心（4℃、1000轉、8分鐘），然後用高糖培養基重懸，計數，約為15×10/毫升；

（2）加入6孔板，330微升細胞懸液/孔，再加670微升的高糖培養基/孔（序貫法加液），分為：生理鹽水和不同濃度給藥組。每組3個復孔，然後分別加入生理鹽水和不同濃度的小牛脾提取物各1000微升至對應的孔中，使小牛脾提取物的終濃度分別達到：0，31.2，125和500微升/毫升。振搖孔板數次，以使細胞混勻，然後放入CO₂培養箱中，培養8小時。將細胞收集於2毫升EP管中，離心（4℃，1000轉×8分鐘），吸取上清置於另一2毫升EP管中，用於測定上清中的乳酸含量；細胞用於測定總蛋白含量（所有EP管均需標明1，2，3等序號，以保證乳酸測定數據和蛋白測定數據可以準確對應）；

（4）上清液預處理：分別轉移3份體積的上清液或乳酸標準品溶液於1份體積的20％冰高氯酸中，然後冰上孵育至少30分鐘，離心（4℃，13000轉，6分鐘），轉移上清於另一個EP管中，-20℃凍存備用。剩餘操作嚴格按照試劑盒要求進行；

（5）細胞總蛋白提取及含量測定：每管加入細胞裂解液200微升，用渦旋混合器震盪30s以使細胞充分裂解，離心（4℃，10000轉×5分鐘），吸取上清，-20℃凍存備用。然後採用BCA法測定樣品中蛋白含量；

（6）乳酸濃度校正：用細胞總蛋白校正，單位換算為微米ol/毫克蛋白。

2.6實驗結果

統計結果標明：小牛脾提取物與HL60細胞共培養8小時後，各個濃度的小牛脾提取物組乳酸含量均明顯下降，表明它抑制了HL60細胞的糖酵解過程，因而乳酸生成減少（見表6）。

表6小牛脾提取物對HL60細胞乳酸含量的影響

組別	濃度（微升/毫升）	乳酸（微摩爾/毫克）
生理鹽水	500	66.96±9.17
小牛脾提取物	31.2	51.34±1.60*
	125	44.18±4.51**
	500	40.48±0.26**

與生理鹽水組相比：*P＜0.05，**P＜0.01

3.小牛脾提取物注射液對HL60細胞ATP含量的作用研究

3.1摘要

將HL60細胞在含不同濃度的小牛脾提取物的高糖培養液中培養8小時，離心去除上清，裂解細胞，利用生物發光法檢測胞內ATP水平。結果表明：與生理鹽水組相比，31.2，125和500微升/毫升三個濃度的小牛脾提取物均可顯著降低HL60細胞的ATP水平，提示小牛脾提取物可能抑制HL60細胞的糖酵解。

3.2實驗材料

（1）細胞系：HL60細胞

（3）實驗儀器：20/20nLuminometer，TurnerBioSystems產品；550型酶標儀，美國BIO-RAD產品；AnkeTDL-40B離心機，上海安亭科學儀器廠；MCO-15AC二氧化塘培養箱，日本SANYO產品；DL-CJ-1N高性能無菌實驗台哈爾濱東聯電子技術開發有限公司北京分公司產品；HH-W420數顯三用恆溫水浴箱，江蘇省金壇市榮華儀器製造有限公司

（4）實驗試劑：ATP生物發光檢測試劑盒，威格拉斯生物技術（北京）有限公司產品；氯化鈉：分析純，北京北化精細化學品有限責任公司；RPMI1640培養基：美國GIBCO產品；胎牛血清：PAA產品；G250考馬斯亮藍：北京鼎國生物技術有限公司產品。

3.3實驗方法

（1）收集處於對數生長期、狀態良好的HL60細胞，離心（4℃、1000轉、8分鐘），然後用高糖培養基重懸，計數，約為15×10/毫升。

（3）測定樣品ATP濃度：將細胞收集於2毫升EP管中，離心（4℃，1000轉，8分鐘），棄上清，每管加入1毫升冰PBS清洗細胞，離心，棄上清，每管加入150微升裂解液（EP管應始終置於冰上，因為細胞裂解後釋放的ATP酶可以降解ATP），渦旋震盪30s以使其充分裂解，然後上機檢測（由於發光液不穩定，儘量在配置好2小時內用完；同時，應保持每個樣品的操作時間一致）。其餘操作嚴格按試劑盒要求進行；

（4）測定樣品總蛋白：測定ATP濃度的剩餘樣品用於測定細胞總蛋白含量，採用BCA法（預實驗發現樣品濃度過高，超過標準品線性範圍，稀釋3倍重新測定）；

（5）ATP濃度校正：用細胞總蛋白校正，單位換算為微摩爾/克蛋白。

3.4實驗結果

統計結果表明：HL60細胞在含有小牛脾提取物的高糖培養液培養8小時後，牛脾提取物可濃度地降低HL60細胞的ATP含量（見表7）。提示該提取物可能抑制了腫瘤細胞的糖酵解途徑，因而ATP生成減少。

表7小牛脾提取物對HL60細胞ATP生成的影響

組別	濃度（微升/毫升）	ATP（微摩爾/克）
生理鹽水	500	54.43±4.97
小牛脾提取物	31.2	39.67±6.66**
	125	30.90±5.79**
	500	11.11±2.20**

與生理鹽水組相比：*P＜0.05，**P＜0.01

4.小牛脾提取物注射液對HL60細胞凋亡的影響

4.1摘要

將HL60細胞在含有不同濃度的小牛脾提取物的培養液中培養8小時，離心收集細胞，70％冰乙醇固定過夜，250微克/毫升RNase37℃水浴消化30分鐘，然後上機檢測分析HL60細胞的凋亡率和細胞周期。結果表明：與生理鹽水組相比，高濃度（125微升/毫升）的小牛脾提取物可明顯地增加HL60細胞凋亡率，並明顯增加S期細胞的百分率。

4.2實驗材料

（1）細胞系：HL60細胞

（3）實驗儀器：流式細胞儀（FACS），CaliburBD公司產品；AnkeTDL-40B離心機，上海安亭科學儀器廠；MCO-15AC二氧化塘培養箱，日本SANYO產品；DL-CJ-1N高性能無菌實驗台哈爾濱東聯電子技術開發有限公司北京分公司產品；HH-W420數顯三用恆溫水浴箱，江蘇省金壇市榮華儀器製造有限公司

（4）實驗試劑：RPMI1640培養基：美國GIBCO產品；胎牛血清：PAA產品；RNase，Roc小時e公司產品；碘化丙啶（PI）：北京大學醫學部醫藥衛生分析中心流式分析室提供。

4.3實驗方法

（1）收集處於對數生長期，狀態良好的HL60細胞，離心（4℃，1000轉，8分鐘），然後用高糖培養基重懸，計數，稀釋至5×10/毫升；

（2）加入細胞懸液6孔板毫升/孔（序貫法加液），分為：生理鹽水組、小牛脾提取物注射液高、中、低三個濃度組。每組3個復孔，然後分別加入生理鹽水和不同濃度的小牛脾提取物各1毫升，使小牛脾提取物的終濃度分別達到：0，31.2，62.5和125微升/毫升。振搖孔板數次，以使細胞和藥物混勻，然後放入CO₂培養箱中，培養8小時；

（3）將細胞收集於2毫升EP管中，離心（4℃，1000轉，5分鐘），棄上清，每管加入1毫升冰PBS清洗細胞，離心（4℃，1000轉×5分鐘），吸乾上清，然後加入100微升冰PBS將細胞混懸，再加入80％冰冷乙醇700微升，封口膜封閉，-20℃固定過夜（至少16小時）；

（4）加1毫升含1％血清的PBS，然後離心（4℃，1000轉，5分鐘）去除固定液，棄上清，再用1毫升含1％血清的PBS清洗，離心，吸乾上清，然後先加入225微升PBS，混勻，再加入RNase（75微升，1毫克/毫升），使RNase終濃度達到250微克/毫升。然後37℃水浴中消化30分鐘；

（5）將樣品轉移入流式管中，每管加入1滴PI染液，然後上機檢測。

4.4實驗結果

結果顯示：小牛脾提取物低、中濃度有增加HL60細胞凋亡率的趨勢，高濃度可顯著增加細胞凋亡率，提示高濃度小牛脾提取物可誘導HL60細胞發生凋亡（見表8）；中濃度增加S期細胞比例，提示該提取物可能幹擾細胞的DNA合成，將細胞阻滯在S期（見表9）。

表8小牛脾提取物對HL60細胞凋亡的影響

組別	濃度（微升/毫升）	凋亡率
生理鹽水	一	6.94±2.52
小牛脾提取物	31.2	10.07±3.80
	125	16.77±1.00
	500	46.45±10.15**

與生理鹽水組相比：**P＜0.01

表9小牛脾提取物對HL60細胞周期的影響

組別	濃度（微升/毫升）	S期比例
生理鹽水	一	39.75±0.61
小牛脾提取物	62.5	48.89±0.58**

與生理鹽水組相比：**P＜0.01

實施案例

實施例1

領取乳牛的脾臟（出生24小時以內），除去掉結締組織和脂肪，用0.9％氯化鈉溶液清洗，加入3倍量的生理鹽水進行勻漿，一般進行3次，膠體磨粒度為4微米；將勻漿液放入冰庫-20℃深凍，達到完全凍結後，取出放入30℃以下水浴中解凍，完全融化後繼續放入冰庫，如此反覆進行三次；將凍融後的藥液70℃保溫35分鐘，速降溫至15℃；將上述溶液離心，離心速度為3500轉/分，溫度5℃以下，離心20分鐘，收集上清液；分別用80000道爾頓、10000道爾頓、7000道爾頓的膜超濾；0.20微米濾芯無菌過濾分裝，即得注射液，小牛脾提取物注射液2.5毫升中含6.25毫克多肽，475微克核糖。

實施例2

領取乳牛的脾臟（出生24小時以內），除去掉結締組織和脂肪，用0.9％氯化鈉溶液清洗，加入4倍量的生理鹽水進行勻漿，一般進行4次，膠體磨粒度為3微米；將勻漿液放入冰庫30℃深凍，達到完全凍結後，取出放入40℃以下水浴中解凍，完全融化後繼續放入冰庫，如此反覆進行三次；將凍融後的藥液80℃保溫40分鐘，速降溫至20℃；將上述溶液離心，離心速度為3000轉/分，溫度4℃以下，離心30分鐘，收集上清液；分別用60000道爾頓、9000道爾頓、6000道爾頓的膜超濾；0.20微米濾芯無菌過濾分裝，即得注射液。小牛脾提取物注射液2.5毫升中含9毫克多肽，600微克核糖。

實施例3

領取乳牛的脾臟（出生24小時以內），除去掉結締組織和脂肪，用0.9％氯化鈉溶液清洗，加入2倍量的生理鹽水進行勻漿，一般進行2次，膠體磨粒度為5微米；將勻漿液放入冰庫-15℃深凍，達到完全凍結後，取出放入25℃以下水浴中解凍，完全融化後繼續放入冰庫，如此反覆進行三次；將凍融後的藥液80℃保溫35分鐘，速降溫至10℃；將上述溶液離心，離心速度為3000轉/分，溫度2℃以下，離心20分鐘，收集上清液；分別用60000道爾頓、9000道爾頓、5000道爾頓的膜超濾；0.20微米濾芯無菌過濾分裝，即得注射液。小牛脾提取物注射液2.5毫升中含10.5毫克多肽，950微克核糖。

實施例4：藥劑盒

該藥劑盒中裝有：臨床日用劑量環磷醯胺注射液、臨床日用劑量小牛脾提取物注射液；

小牛脾提取物注射液的製備：領取乳牛的脾臟（出生24小時以內），除去掉結締組織和脂肪，用0.9％氯化鈉溶液清洗，加入3倍量的生理鹽水進行勻漿，一般進行3次，膠體磨粒度為4微米；將勻漿液放入冰庫-20℃深凍，達到完全凍結後，取出放入30℃以下水浴中解凍，完全融化後繼續放入冰庫，如此反覆進行三次；將凍融後的藥液70℃保溫35分鐘，速降溫至15℃；將上述溶液離心，離心速度為3500轉/分，溫度5℃以下，離心20分鐘，收集上清液；分別用80000道爾頓、10000道爾頓、7000道爾頓的膜超濾；0.20微米濾芯無菌過濾分裝，即得注射液，小牛脾提取物注射液2.5毫升中含6.25毫克多肽，475微克核糖。

環磷醯胺成人常用量：單藥靜脈注射按體表面積每次500～1000毫克/平方米，加生理鹽水20～30毫升，靜脈注入，每周1次，連用2次，休息1～2周重複。

小牛脾提取物注射液，靜脈滴註：一次10毫升，溶於500毫升的0.9％氯化鈉注射液或5％-10％葡萄糖注射液中，一日1次。

實施例5

藥劑盒，由置於包裝單位中的許多獨立包裝且各自可取出的28個日劑量單位組成，每七個日劑量單位為一組，共分為四組；每組中第一個日劑量單位包含8克環磷醯胺注射液與小牛脾提取物注射液10毫升（2毫升/支×5支），其餘六個日劑量單位包含小牛脾提取物注射液10毫升（2毫升/支×5支）。

小牛脾提取物注射液的製備：領取乳牛的脾臟（出生24小時以內），除去掉結締組織和脂肪，用0.9％氯化鈉溶液清洗，加入4倍量的生理鹽水進行勻漿，一般進行4次，膠體磨粒度為3微米；將勻漿液放入冰庫30℃深凍，達到完全凍結後，取出放入40℃以下水浴中解凍，完全融化後繼續放入冰庫，如此反覆進行三次；將凍融後的藥液80℃保溫40分鐘，速降溫至20℃；將上述溶液離心，離心速度為3000轉/分，溫度4℃以下，離心30分鐘，收集上清液；分別用60000道爾頓、9000道爾頓、6000道爾頓的膜超濾；0.20微米濾芯無菌過濾分裝，即得注射液。小牛脾提取物注射液2.5毫升中含9毫克多肽，600微克核糖。

抗腫瘤使用時按照該藥劑盒的劑量單位的順序拿出使用。環磷醯胺，加生理鹽水20～30毫升，靜脈注入。小牛脾提取物注射液，靜脈滴註：一次10毫升，溶於500毫升的0.9％氯化鈉注射液或5％-10％葡萄糖注射液中。

實施例6：藥劑盒

藥劑盒，由置於包裝單位中的許多獨立包裝且各自可取出的14個日劑量單位組成，每七個日劑量單位為一組，共分為兩組；每組中第一個日劑量單位包含8克環磷醯胺注射液與小牛脾提取物注射液10毫升（2毫升/支×5支），其餘六個日劑量單位包含小牛脾提取物注射液10毫升（2毫升/支×5支）。

小牛脾提取物注射液的製備：領取乳牛的脾臟（出生24小時以內），除去掉結締組織和脂肪，用0.9％氯化鈉溶液清洗，加入2倍量的生理鹽水進行勻漿，一般進行2次，膠體磨粒度為5微米；將勻漿液放入冰庫-15℃深凍，達到完全凍結後，取出放入25℃以下水浴中解凍，完全融化後繼續放入冰庫，如此反覆進行三次；將凍融後的藥液80℃保溫35分鐘，速降溫至10℃；將上述溶液離心，離心速度為3000轉/分，溫度2℃以下，離心20分鐘，收集上清液；分別用60000道爾頓、9000道爾頓、5000道爾頓的膜超濾；0.20微米濾芯無菌過濾分裝，即得注射液。小牛脾提取物注射液2.5毫升中含10.5毫克多肽，950微克核糖。

榮譽表彰

2019年10月，《一種治療腫瘤的小牛脾提取物》獲得第三屆吉林省專利獎優秀獎。

一種治療腫瘤的小牛脾提取物

基本介紹

專利背景

發明內容

專利目的

技術方案

權利要求

實施方式

實驗案例

實施案例

榮譽表彰

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