《一種枯草芽孢桿菌及其在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用》是南京軒凱生物科技有限公司和南京工業大學於2012年11月16日申請的專利，該專利的申請號為2012104641706，公布號為CN102965311A，授權公布日為2013年3月13日，發明人是徐虹、馮小海、張丹、李莎、粱金豐。
《一種枯草芽孢桿菌及其在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用》公開一種枯草芽孢桿菌其分類命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）PG-8，已保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，登記入冊的編號是CGMCC NO.6324，保藏日期是2012年7月10日。該發明還公開了上述枯草芽孢桿菌在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用。利用該菌株在僅含有L-谷氨酸的培養基中培養，在最佳化條件下能積累γ-D-聚谷氨酸30~60克/升。該菌株能利用多種碳源和氮源，培養條件粗放，操作方便簡單，γ-D-聚谷氨酸產量高，生產成本低，能廣泛套用於植物保水，食品添加等領域。
2016年12月7日，《一種枯草芽孢桿菌及其在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種枯草芽孢桿菌及其在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用
- 公布號：CN102965311A
- 授權日：2013年3月13日
- 申請號：2012104641706
- 申請日：2012年11月16日
- 申請人：南京軒凱生物科技有限公司、南京工業大學
- 地址：江蘇省南京市高新開發區15號樓509-5室
- 發明人：徐虹、馮小海、張丹、李莎、粱金豐
- Int.Cl.：C12N1/20(2006.01)I；C12P13/02(2006.01)I；C12R1/125(2006.01)N
- 代理機構：南京蘇高專利商標事務所（普通合夥）
- 代理人：肖明芳
- 類別：發明專利
- 生物保藏 ：CGMCC NO. 6324 2012.07.10
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamicacid,簡稱γ-PGA）是由多種桿菌（如炭疽芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等）產生的一種胞外聚合物。γ-PGA是谷氨酸單體以γ-羧基與氨基相縮合的一種均聚胺基酸，主鏈為nylon-4結構（1）。γ-PGA具有極佳的生物可降解性、成膜性、成纖維性、可塑性、粘結性、保濕性等許多獨特的理化和生物學特性，在注重環保、強調可持續發展的今天，γ-PGA及其衍生物有廣闊的套用前景。可用於化妝品、食品、分散劑、螯合劑、建築塗料、防塵等領域。
截至2012年11月發現的聚γ-PGA產生菌主要集中在芽孢桿菌屬（Bacillussp.），包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、地衣芽孢桿菌（B.lichemiformis）和短小芽孢桿菌（B.pumilus）等。至今發現的在枯草芽孢桿菌中發酵生產的γ-PGA都為γ-D,L-PGA。而高聚物的單體構型往往會影響產品的性能和套用。L-異構體含量高的γ-PGA可以更好的套用在化妝品領域及降解材料；D-異構體含量高的γ-PGA則更適用於農業保水劑及食品添加劑等方面。在γ-PGA工業化生產方面，美國ADM公司、日本明治制果、味之素和台灣味丹企業等已對γ-PGA進行了商業化試生產。中國國內在該領域的研究相對起步較晚，與其它國家與機構相比還是存在一定的差距。關於γ-PGA工業化生產方面，尤其是在套用方面的研究都較少。
截至2012年11月，未見高光學純度天然γ-PGA的產業化生產。
發明內容
專利目的
《一種枯草芽孢桿菌及其在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用》所要解決的技術問題是提供一株能夠產高光學純度的γ-D-PGA的枯草芽孢桿菌。
該發明還要解決的技術問題，是提供上述枯草芽孢桿菌的套用。
技術方案
《一種枯草芽孢桿菌及其在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用》的發明人實驗室選育的微生物菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）PG-8，該菌株保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC），保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，郵編：100101。登記入冊的編號是CGMCC NO.6324，保藏日期是：2012年7月10日。以此菌作為生產菌株。
CGMCC NO.6324菌株具有下述性質：
1、菌落形態學特徵：
在蛋白腖瓊脂培養基上營養細胞為0.7~1.0×1.5~2.7微米大小的桿菌，37℃培養2~3天形成芽孢，芽孢為長圓形或圓柱狀。在上述培養基中32℃培養12小時菌體可以大量生長。菌落呈白色，邊緣有褶皺，不透明，不閃光。
2、生理與生化特性：
（1）培養溫度：28~37℃，最適溫度為32℃；
（2）在pH6.0~7.5範圍內生長；
（3）革蘭氏染色：陽性；
（4）甲基紅實驗：陰性；
（5）硝酸鹽還原：陽性；
（6）吲哚生產：陰性；
（7）H2S生產：陰性；
（8）耐NaCl濃度：7%濃度以上可以生長。
3、16SrDNA序列分析：
測得16SrDNA大部分序列1443bp，如SEQIDNo：1所示。將所測序列從GeneBank資料庫中的相關種進行比較，構建16SrDNA全序列為基礎的系統發育樹。結果表明：菌株與枯草芽孢桿菌達到99.9%同源。所以認定《一種枯草芽孢桿菌及其在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用》使用的是枯草芽孢桿菌，具體為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）PG-8。
4、營養特徵：
枯草芽孢桿菌的培養基中不需要添加生長因子，可以利用多種化合物作為碳源，這些物質既可以單獨使用，也可以適當的比例復配充當碳源。有機氮或無機氮都可以作為氮源使用。培養基中各組分用量為：碳源10~90克/升，氮源1~40克/升，無機鹽0.01~25克/升，其餘為水。碳源一般採用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、檸檬酸、甘油和糖蜜中的一種或多種；氮源可採用牛肉膏、蛋白腖、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、（NH4）2SO4、NH4Cl和NH4NO3中的一種或多種；培養基中還包括鉀鹽、鈉鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽和鹽酸鹽等常用的無機鹽類。
上述枯草芽孢桿菌在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用。
具體的方法是：將菌株CGMCC NO.6324接種於含有谷氨酸或谷氨酸鹽、碳源、氮源、無機鹽和水的無菌發酵培養基中，在合適生長的條件下進行好氧培養，生成的發酵液經提取可得到γ-D-聚谷氨酸。
其中，所述的發酵培養基包含如下組分：谷氨酸或谷氨酸鹽1~90克/升，碳源10~90克/升，氮源1~40克/升，無機鹽0.01~25克/升，其餘為水，pH6.0~7.5。
其中，所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、檸檬酸、甘油和糖蜜中的任意一種或幾種的組合；氮源為牛肉膏、蛋白腖、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、（NH4）2SO4、NH4Cl和NH4NO3中的任意一種或幾種的組合；無機鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽和鹽酸鹽中的一種或多種。其中，所述的合適生長的條件是：初始pH為6.0~7.5、培養溫度為28~37℃、培養時間為24~72小時。
其中，發酵結束後，除去菌體的發酵液可提取γ-D-PGA。
其中，製備得到的γ-聚谷氨酸中，D-異構體含量為100%。
具體地說：
《一種枯草芽孢桿菌及其在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用》提供的製備γ-D-PGA的方法，是將菌株CGMCCNo.6324的接種到斜面1~2天后（斜面培養基採用牛肉膏蛋白腖培養基），在含有碳源、氮源和無機鹽的培養基上培養24~72小時，可以生成30~60克/升γ-D-PGA，通常發酵條件還包括：培養基為：葡萄糖或糖蜜10~90克/升，L-谷氨酸10~90克/升，（NH4）2SO41~5克/升，K2HPO41~20克/升。發酵溫度28~37℃，較佳的為30~37℃；培養基的初始pH範圍為6.0~7.5，較佳的為6.8~7.2；好氧培養。
有益效果
（1）《一種枯草芽孢桿菌及其在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用》篩選到一株γ-PGA生產菌，該菌能利用多種碳源和氮源發酵生產γ-D-PGA，操作方便簡單，培養條件十分粗放。
（2）該菌株可以合成高光學純度的γ-D-PGA，即D-異構體含量100%。
（3）可以使用纖維素水解糖液（替代葡萄糖或蔗糖）、豆餅粉（替代酵母膏或蛋白腖）和味素廢水（替代谷氨酸）作為γ-PGA發酵培養基的碳源、氮源和合成前體，使發酵原料成本大幅下降。
附圖說明
圖1為水解液薄層層析，其中，1,4谷氨酸標樣；2,3γ-PGA水解液。
圖2為L-/D-型谷氨酸混合單體標準品液相色譜圖。
圖3為水解液液相色譜圖。
技術領域
《一種枯草芽孢桿菌及其在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用》屬於發酵工程技術領域，涉及一種高產γ-D-聚谷氨酸（γ-D-PGA）的微生物菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）及其套用。
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）PG-8，已保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，登記入冊的編號是CGMCC NO.6324，保藏日期是2012年7月10日。
2.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用。
3.根據權利要求2所述的套用，其特徵在於，將菌株CGMCC NO.6324接種於含有谷氨酸或谷氨酸鹽、和碳源、和氮源、和無機鹽和水的無菌發酵培養基中，在合適生長的條件下進行好氧培養，生成的發酵液經提取可得到γ-D-聚谷氨酸；所述的合適生長的條件是：初始pH為6.0～7.5、培養溫度為28～37℃、培養時間為24～72小時。
4.根據權利要求3所述的套用，其特徵在於，所述的發酵培養基由如下組分組成：谷氨酸或谷氨酸鹽1～90克/升、碳源10～90克/升，氮源1～40克/升，無機鹽0.01～25克/升，其餘為水，pH6.0～7.5；所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、檸檬酸、甘油和糖蜜中的任意一種或幾種的組合；氮源為牛肉膏、蛋白腖、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、尿素、（NH4）2SO4、NH4Cl和NH4NO3中的任意一種或幾種的組合；無機鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽和鹽酸鹽中的一種或多種。
5.根據權利要求2至4中任一項所述的套用，其特徵在於，製備得到的γ-聚谷氨酸中，D-異構體含量為100％。
實施方式
實施例1：7.5升罐分批發酵B.subtilisPG-8生產γ-D-PGA。
種子培養基：葡萄糖5克/升，牛肉膏5克/升，蛋白腖5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，利用NaOH溶液調pH6.8。
發酵培養基：葡萄糖40克/升，味素40克/升，酵母膏5克/升，（NH4）2SO45克/升，K2HPO4·3H2O2.5克/升，MgSO4·7H2O0.1克/升，利用NaOH溶液調pH6.8。
將枯草芽孢桿菌B.subtilisPG-8（CGMCC NO:6324）在種子培養基、30℃、200轉/分鐘的搖床條件下培養15小時，將種子液按5%（v/v）的種子量接種於預裝有4.5L滅菌後的發酵培養基的發酵罐中進行培養，培養條件：30℃，400轉/分鐘，通氣量1.2升/分鐘，發酵過程中開啟pH自動控制裝置，利用HCl或氨水控制發酵液pH值在6.5-7.5之間。發酵48小時，γ-D-PGA濃度達到40.2克/升。
取發酵液用濃鹽酸調pH2.8-3.5，9000轉/分鐘離心30分鐘去除菌體，取上清加入2-5倍體積的乙醇，將沉澱用水復溶，透析去除小分子物質，濾液冷凍乾燥得到γ-PGA粗品。用該粗品配製1克/升溶液，1.5毫升溶液加入1.5毫升濃鹽酸，裝入安瓿瓶中密封，110℃水解24-36小時，取出後用6摩爾/升NaOH調pH6.5-7.0，得到谷氨酸水解液。將水解液進行薄層層析分析，薄層：纖維素、矽膠GF254，鋪板（自製）；展開劑：正丁醇:冰醋酸:吡啶:水=4:1:1:2（V/V）；顯色劑：0.2%的茚三酮正丁醇溶液。結果如圖1所示，水解液在矽膠板上只有一個斑點，且與谷氨酸標液一致，表明γ-PGA被完全水解成谷氨酸單體，無殘留高聚物。
採用蒸發光散射檢測器測定γ-PGA水解液中總谷氨酸濃度，條件如下：流動相：2%乙腈，0.2%三氟乙酸，0.06%七氟丁酸；流速：0.5毫升/分鐘；蒸發室溫度：117℃；氮氣流速：3.2升/分鐘。γ-PGA水解液中L-谷氨酸濃度採用SBA-40C型生物感測器檢測，該儀器利用L-谷氨酸酶膜專一檢測L-型谷氨酸單體。檢測結果未在SBA中檢測到L-型谷氨酸單體，故證實該產物為100%γ-D-PGA。
實施例2：7.5升罐分階段控制轉速發酵B.subtilisPG-8生產γ-D-PGA。
種子培養基：葡萄糖5克/升，牛肉膏5克/升，蛋白腖5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，利用NaOH溶液調pH7.0。
發酵培養基：酸處理糖蜜20克/升，葡萄糖10克/升，蔗糖10克/升，蛋白腖2克/升，（NH4）2SO45克/升，味素廢水80克/升，K2HPO4·3H2O2.5克/升，MgSO4·7H2O0.1克/升，利用NaOH溶液調pH7.0。
將枯草芽孢桿菌B.subtilisPG-8（CGMCC NO:6324）在種子培養基、32℃、220轉/分鐘的搖床條件下培養16小時，將種子液按5%（v/v）的種子量接種於預裝有4.5升滅菌後的發酵培養基的發酵罐中進行培養，培養條件：整個發酵過程中保持溫度32℃，通氣量1.2升/分鐘，發酵過程中開啟pH自動控制裝置，利用HCl或NaOH控制發酵液pH值在6.8-7.2之間。轉速控制條件：0~12小時，600轉/分鐘；12~48小時，400轉/分鐘，在此條件下，γ-D-PGA濃度達到48.5克/升。
γ-PGA粗品及水解液製備同實施例1中所述。
採用色譜柱Shim-packVP-ODS（250毫米×4.6毫米，5微米）檢測水解液中D-型、L-型谷氨酸單體。流動相A：0.05摩爾/升醋酸鈉溶液，流動相B：甲醇:乙腈（V:V）=45:55；梯度洗脫程式：0-25分鐘，4.5%-5.5%B，25-40分鐘,5.5%-15.5%B；流速：1.0毫升/分鐘；柱溫：20℃；螢光檢測波長：λEx=340納米，λEm=445納米；進樣量：10微升。用L-型谷氨酸單體及D-型谷氨酸單體配製成混合標液進樣，結果如圖2所示，L-型及D-型單體可以很好地分開；再將水解液進樣，結果如圖3所示，表明水解液中不存在L-型單體。
實施例3：7.5L罐補料分批發酵B.subtilisPG-8生產γ-D-PGA。
種子培養基：葡萄糖5克/升，牛肉膏5克/升，蛋白腖5克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，利用NaOH溶液調pH6.8。
發酵培養基：糖蜜90克/升，蛋白腖5克/升，（NH4）2SO45克/升，味素廢水90克/升，K2HPO4·3H2O2.5克/升，MgSO4·7H2O0.1克/升，利用NaOH溶液調pH6.8。
將枯草芽孢桿菌B.subtilisPG-8（CGMCC NO:6324）在種子培養基、32℃、200轉/分鐘的搖床條件下培養16小時，將種子液按4%（v/v）的種子量接種於預裝有4.5升滅菌後的發酵培養基的發酵罐中進行培養，培養條件：32℃，400轉/分鐘，通氣量1.4升/分鐘，發酵過程中開啟pH自動控制裝置，利用HCl或NaOH控制發酵液pH值在6.8-7.2之間。當發酵液中殘留總糖在10克/升時，打開補料裝置，將含糖濃度為500克/升的糖蜜補入發酵液中，控制發酵液中糖濃度保持在10~15克/升左右，進行補料發酵。發酵72小時，γ-D-PGA濃度達到58.5克/升。
γ-PGA粗品及水解液製備同實施例1中所述。
水解液中L-型、D-型單體檢測同實施例1中所述。
實施例4：1噸發酵罐發酵B.subtilisPG-8生產γ-D-PGA。
一級種子培養基：葡萄糖5克/升，牛肉膏2克/升，蛋白腖2.5克/升，（NH4）2SO45克/升，MgSO4·7H2O0.25克/升，K2HPO4·3H2O1克/升，NaCl1克/升，谷氨酸鈉1克/升，pH7.0。
二級種子培養基：糖蜜20克/升，葡萄糖2克/升，牛肉膏2克/升，蛋白腖5克/升，（NH4）2SO45克/升，KH2PO40.2克/升，K2HPO4·3H2O2克/升，MgSO4·7H2O0.25克/升，pH7.0。
發酵培養基：葡萄糖90克/升，蛋白腖3克/升，（NH4）2SO45克/升，K2HPO4·3H2O10克/升，KH2PO40.5克/升，MgSO4·7H2O0.25克/升，谷氨酸40克/升，pH7.0。
一級種子製備：將B.subtilisPG-8（CGMCC NO:6324）接種於若干500毫升三角瓶液體培養基中，三角瓶裝液量100毫升，30℃，200轉/分鐘培養16小時。
二級種子製備：按3%（v/v）接種量將一級種子接種在300升發酵罐中進行擴大培養。通風量為9立方米/小時，攪拌轉速為120轉/分鐘，32℃下培養8小時。
1噸發酵罐生產：按接種量為2%（v/v）將二級種子接種到1噸發酵罐中，通風量200立方米/小時，攪拌轉速為100轉/分鐘，32℃下培養。發酵過程中開啟pH自動控制裝置，利用HCl或NaOH控制發酵液pH值在6.8-7.2之間。當發酵液中殘留總糖在15克/升時，打開補料裝置，將母液濃度為500克/升的葡萄糖補入發酵液中，控制發酵液中總糖濃度保持在10~15克/升，發酵72小時，γ-D-PGA濃度達53.6克/升。
γ-PGA粗品及水解液製備同實施例1中所述。
水解液中L-型、D-型單體檢測同實施例2中所述。
實施例5：10噸發酵罐發酵B.subtilisPG-8生產γ-D-PGA。
一級種子培養基：糖蜜20克/升，葡萄糖5克/升，牛肉膏2克/升，蛋白腖2.5克/升，（NH4）2SO45克/升，MgSO4·7H2O0.25克/升，K2HPO4·3H2O1克/升，NaCl1克/升，谷氨酸鈉1克/升，pH6.8。
二級種子培養基：糖蜜20克/升，葡萄糖5克/升，牛肉膏2克/升，蛋白腖5克/升，（NH4）2SO45克/升，KH2PO40.2克/升，K2HPO4·3H2O2克/升，MgSO4·7H2O0.25克/升，pH6.8。
發酵培養基：糖蜜60克/升，葡萄糖20克/升，蛋白腖3克/升，（NH4）2SO45克/升，K2HPO4·3H2O10克/升，KH2PO40.5克/升，MgSO4·7H2O0.25克/升，味素廢水30克/升，谷氨酸10克/升，pH6.8。
一級種子製備：將B.subtilisPG-8（CGMCC NO:6324）接種於若干500毫升三角瓶液體培養基中，三角瓶裝液量100毫升，37℃，200轉/分鐘培養14小時。
二級種子製備：按4%（v/v）接種量將一級種子接種在300升發酵罐中進行擴大培養。通風量為9立方米/小時，攪拌轉速為120轉/分鐘，32℃下培養8小時。
10噸發酵罐生產：按接種量為2%（v/v）將二級種子接種到10噸發酵罐中，通風量240立方米/小時，攪拌轉速為60轉/分鐘，32℃下培養。發酵過程中開啟pH自動控制裝置，利用HCl或NaOH控制發酵液pH值在6.8-7.2之間。當發酵液中殘留總糖在15克/升時，打開補料裝置，將母液濃度為500克/升的糖蜜及葡萄糖補入發酵液中，控制發酵液中總糖濃度保持在10~15克/升，發酵72小時，γ-D-PGA濃度達46.1克/升。
γ-PGA粗品及水解液製備同實施例1中所述。
水解液中L-型、D-型單體檢測同實施例2中所述。
榮譽表彰
2016年12月7日，《一種枯草芽孢桿菌及其在製備γ-D-聚谷氨酸中的套用》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
