《一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產煙醯胺中的套用》是南京第一農藥集團有限公司於2009年12月18日申請的發明專利，該專利申請號為2009102643029，公布號為CN101712944A，專利公布日為2010年5月26日，發明人是楊壽海、孔國平、陳金福、韋琛鴻、趙廣福。
《一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產煙醯胺中的套用》屬於生物化工領域，公開了一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產煙醯胺中的套用。枯草芽孢桿菌CGMCC NO.3242，其產生的腈水合酶能催化3-氰基吡啶進行水合反應生成煙醯胺。利用枯草芽孢桿菌CGMCC NO.3242生物催化生產煙醯胺的工藝為以3-氰基吡啶為底物，以枯草芽孢桿菌CGMCCNO.3242為生物催化劑，採用底物和生物催化劑耦合補加的方式進行催化水合反應得到煙醯胺。該發明有效的降低了高濃度底物和產物對細胞的毒害作用，有利於得到高濃度的煙醯胺水合液，其中煙醯胺的濃度不低於25％，有利於產物分離。
2019年5月16日，《一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產煙醯胺中的套用》獲得安徽省第六屆專利獎金獎。
基本介紹
- 中文名：一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產煙醯胺中的套用
- 公布號：CN101712944A
- 公布日：2010年5月26日
- 申請號：2009102643029
- 申請日：2009年12月18日
- 申請人：南京第一農藥集團有限公司
- 地址：江蘇省南京市高淳縣寶塔路269號
- 發明人：楊壽海、孔國平、陳金福、韋琛鴻、趙廣福
- 代理機構：南京天華專利代理有限責任公司
- 代理人：徐冬濤
- Int.Cl.：C12N1/20(2006.01)I；C12P17/12(2006.01)I；C12R1/125(2006.01)N
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,專利保護,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
煙醯胺俗名VB3，又名尼克醯胺（Nicotinamide、Niacinamide），化學名為3-吡啶甲醯胺，吡啶-3-甲醯胺等，分子式C6H6N2O，分子量122.13，為白色針狀結晶或粉末，熔點129～131℃，比重1.400。易溶於水、能溶於乙醇和甘油，不溶於醚，無臭、略帶苦味，微毒。煙酸、煙醯胺屬B族維生素，統稱維生素PP，在實際套用中可等量替代，自然界的煙酸存在於肝、腎、酵母和米糠中，是生物體內脫氫輔酶I或II的組分，參與碳水化合物、脂肪和蛋白質的代謝。它們在醫藥中可用於治療糙皮病等，還可以添加到食品和麵粉中用以補充人體所需的維生素，其最大的套用領域是用作飼料添加劑。
工業上，煙醯胺、煙酸主要是以吡啶類化合物為原料生產的，世界煙醯胺、煙酸的生產主要集中在西歐和美國，日本也有少量生產。全球煙醯胺、煙酸年產能4.2萬t/a，年產量達3.0萬噸，主要生產國有瑞士、比利時、美國、日本及中國等。主要生產廠家有瑞士龍沙（1.5萬t/a）、比利時德固賽（能力為8500t/a）、美國Reilly、日本Yuyigosei公司以及美國內貝塔公司等。中國生產廠家受原料進口限制，生產規模普遍較小，主要有廣州龍沙（屬於瑞士龍沙）、江蘇南通醋酸化工、浙江新昌製藥廠等。
在生產中主要的工藝就是將3-甲基吡啶（PIC）氨氧化生成3-氰基吡啶（NSN），再經化學水解得到煙醯胺或煙酸。瑞士龍沙公司以2-甲基-1，5-戊二胺（MPDA）為原料合成3-甲基吡啶，再經生化水解得煙醯胺，該技術的套用使龍沙公司的煙醯胺生產技術在世界上處於領先地位。其中的生化法主要工藝如下：使用第三代丙烯醯胺菌種Rhodococcus rhodochrous J1的固定化細胞將3-氰基吡啶水解為煙醯胺，採用連續攪拌釜，沿工藝流程方向將濃度為10～20％的3-氰基吡啶連續進料，並逆流投入生物催化劑。酶水解生產所需要的醯胺的選擇性＞99％，轉化率為100％。
截至2009年12月，中國不少單位在丙烯腈生物催化合成丙烯醯胺的研究中，對腈水合酶/腈水解酶菌種的篩選和工業化套用也進行了較深入的研究，研究單位有上海農藥所，浙江工業大學，清華大學和中科院生命有機化學國家重點實驗室等。其中上海農藥所先後承擔了國家“七五”，“八五”，“九五”期間丙烯醯胺的工業化生產相關的重大課題，並成功開發出了煙腈微生物催化為煙醯胺技術，且申請有專利。在此基礎上，並於2003年7月份在與浙江醫藥股份有限公司合作，在浙江來益生物技術有限公司建立了0.2wt/a規模的煙醯胺生產裝置。
如上海市農藥研究所的專利CN1424402中報導了採用丙酸棒桿菌產生的腈水合酶將3-氰基吡啶轉化成煙醯胺。在轉化過程中，當產物濃度≥5％時用ultraflow膜過濾系統出產物，同時開始補加3-氰基吡啶和水，等產物的累積濃度≥10％以後一次性出罐。瑞士龍沙股份有限公司的專利CN1154364A中報導了採用固定化的紅球菌屬rhodochrous微生物，再多段連續槽形反應器中進行3-氰基吡啶的催化水合反應。其反應液中3-氰基吡啶的含量在10～20％重量之間，因此，反應結束後產物煙醯胺的濃度也基本不超過20％。
浙江愛迪亞營養科技開發有限公司的專利CN1952114A中報導了一種產腈水合酶的谷氨酸棒桿菌，經過固定化處理後在水溶液中轉化3-氰基吡啶，最終在反應物總重量中所加入的3-氰基吡啶的重量為10～25％。
以上專利都是採用生物催化的方法，以3-氰基吡啶為底物，產腈水合酶的微生物作生物催化劑進行水合反應。期間向反應釜中一次性添加生物催化劑，連續或間隙的補加底物3-氰基吡啶進行水合反應，反應結束後得到濃度較低的煙醯胺反應液。以上傳統生物催化工藝的不足之處在於生物催化劑一次性加入，隨著反應時間的延長，細胞受底物和產物的抑制效果逐漸增加，反應速度下降，酶活降低，只能被動的在較低產物濃度時選擇放料，最終難以得到高濃度的產物。
發明內容
專利目的
《一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產煙醯胺中的套用》的目的是針對2009年12月之前技術的不足，提供一株新的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）CGMCCNO.3242。該發明的另一目的是提供該細菌在生物催化生產煙醯胺中的套用。
技術方案
《一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產煙醯胺中的套用》的目的可以通過以下措施達到：
一株枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）CGMCCNO.3242，其發酵產物是產腈水合酶的細胞，腈水合酶能催化3-氰基吡啶進行水合反應生成煙醯胺。
枯草芽孢桿菌KR2（CGMCCNo.3242）具有以下微生物學特徵：
1.形態學特徵
在固體平板培養基上培養48小時後出現圓形光滑的單菌落，灰白色，不透明，表面濕潤，邊緣光滑，整個菌落凸起，易挑取；鏡檢成桿狀，大小長為（0.5～0.8微米）×（1.5～2.5微米），芽孢中生。
2.培養學特徵
該菌株在以下3種培養基中30℃下培養48～96小時後的培養特徵見表1。
培養基名稱 | 菌落顏色和形狀 |
|---|---|
營養瓊脂 | 菌落凸起，表面濕潤，邊緣光滑，不透明，呈乳白色至灰白色，無可溶性色素 |
營養肉湯 | 生長旺盛，灰黃色，渾濁 |
蛋白腖茶室瓊脂 | 菌落平坦而厚，表面濕潤，邊緣光滑，不透明，灰黃色，無可溶性色素 |
3.生理生化特徵
項目 | 生理生化特徵 | 項目 | 生理生化特徵 |
|---|---|---|---|
需氧試驗 | 好氧 | H2O2酶實驗 | + |
v.P.反應 | + | 氧化酶實驗 | - |
M.R.試驗 | - | 脲酶 | + |
油脂水解 | + | 明膠液化 | + |
酪素水解 | + | 石蕊牛奶反應 | + |
酪氨酸水解 | - | 從甘油產二羥丙酮 | - |
澱粉水解 | + | 碳源產酸 | |
馬尿酸鹽水解 | - | 葡萄糖 | + |
纖維素分解 | - | 蔗糖 | + |
耐鹽濃度 | 7% | 木糖 | - |
生長pH範圍 | 5-9 | 乳糖 | + |
最高生長溫度 | 50℃ | 甘露醇 | + |
革蘭氏染色 | + | 鼠李糖 | + |
形成吲嗓 | - | 麥芽糖 | + |
檸檬酸鹽利用 | - | 阿拉伯糖 | + |
（註：表中+表示陽性，-表示陰性。）
枯草芽孢桿菌KR2（CGMCCNO.3242）的培養方法如下：
（1）種子液製備：先進行枯草芽孢桿菌KR2（CGMCCNO.3242）斜面種子製備，將枯草芽孢桿菌KR2（CGMCCNo.3242）接種到滅過菌的斜面培養基上後在20～35℃下培養3～7天，刮取3～5環菌種接種到裝有已滅菌的液體培養基的三角瓶中，在溫度為20～35℃，轉速為100～300轉/分鐘下振盪培養30～120小時，即可作為枯草芽孢桿菌KR2（CGMCCNo.3242）的一級種子。同樣培養條件下，將一級種子按3～10％（％：v/v）的接種量轉接第二批裝有同樣培養基的三角瓶中，同樣條件下培養30～72小時後作為枯草芽孢桿菌KR2（CGMCCNO.3242）的二級種子。
（2）擴大培養：將枯草芽孢桿菌KR2（CGMCCNO.3242）二級種子以3～10％（％：v/v）的接種量接種到7～300升發酵罐中進行發酵培養，培養條件為：裝液量：60～80％（％：v/v），通氣量：0.1～1（v/v.分鐘），罐壓：0.02～0.05兆帕，溫度：20～35℃，轉速：100～400轉/分鐘，發酵時間：30～120小時。
所涉及的培養基成分如下：
斜面培養基（克/升）：葡萄糖：10～30，酵母膏：2～10，蛋白腖：2～10，氯化鈉：1～5，磷酸二氫鉀：0.5～3，磷酸氫二鉀：0.5～3，硫酸鎂：0.2～2，瓊脂：10～30，pH：5～9，121℃滅菌20分鐘。一級、二級液體種子培養基（克/升）：葡萄糖：10～30，酵母膏：2～10，蛋白腖：2～10，氯化鈉：1～5，磷酸二氫鉀：0.5～3，磷酸氫二鉀：0.5～3，硫酸鎂：0.2～2，尿素：2～20，己內醯胺：0.5～10，氯化鈷：5～50ppm，pH：5～9，121℃滅菌20分鐘。發酵培養基（克/升）：葡萄糖：10～50，酵母膏：2～10，蛋白腖：2～10，氯化鈉：1～5，磷酸二氫鉀：0.5～3，磷酸氫二鉀：0.5～3，硫酸鎂：0.2～2，尿素：2～20，己內醯胺：0.5～10，氯化鈷：5～50ppm，pH：5～9，121℃滅菌20分鐘。
枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）CGMCCNO.3242在生物催化生產煙醯胺中的套用。
一種利用枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）CGMCCNO.3242生物催化生產煙醯胺的工藝如下：以3-氰基吡啶為底物，以枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）CGMCCNO.3242為生物催化劑，採用底物和生物催化劑耦合補加的方式，在溫度為5～35℃，攪拌轉速為100～300轉/分鐘下進行催化水合反應得到煙醯胺。
所述的催化水合反應一般在反應釜中進行，反應釜的裝液體積為50～70％（％：v/v）。3-氰基吡啶的起始添加量為1～10％（％：克/100毫升），生物催化劑的累積添加總量為1～30％（％：克/100毫升），當底物濃度低於0.5克/升時，開始耦合補加底物3-氰基吡啶和生物催化劑，每批的添加量和兩者的起始添加量一致，順序可以互為先後或同時補加，一般連續補加次數為5～20次，最終底物累加濃度可達25％（％：克/100毫升）以上。
所述的催化水合反應一般進行15～96小時，當底物濃度逐漸降低，趨向於零時即可終止。
所述的反應結束後，在2500～3500轉/分鐘下離心10～20分鐘後取上清，或者用0.2～0.5微米膜超濾後置於0～4℃下冷凍1～1.5小時左右即可直接析出大量煙醯胺晶體，將其混合液2500～3500轉/分鐘轉速下冷凍離心10～20分鐘得晶體，30～80℃下真空乾燥即得純度在98％以上的煙醯胺。
改善效果
《一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產煙醯胺中的套用》提供的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）CGMCCNO.3242，該菌株產腈水合酶的總酶活力高，為生物催化法生產煙醯胺提供了優良的菌種。
其他生物催化反應只補加底物，而該發明首次採用底物和催化劑耦合多次補加。底物分批補加，創造出持續低濃度底物的催化反應系統，有效的降低了高濃度底物和產物對細胞的毒害作用；同時，雖然每次底物濃度較低，但通過多次補加，底物的累積濃度較之一次性加入並未降低；另外，催化劑分批補加，使生物催化劑受抑制的累積時間相對減少，有利於維持生物催化劑的活性。底物和催化劑耦合多次補加，將二者分批補加的優勢結合在一起，產生了1+1＞2的效果，有利於得到高濃度的煙醯胺水合液，其中煙醯胺的濃度不低於25％（％：克/100毫升），有利於反應結束後的產物分離。
該發明反應結束後的產物分離部分，含高濃度煙醯胺的水合液勿需經過濃縮處理，可直接經過冷凍結晶、乾燥處理後得到純度在98％以上的煙醯胺晶體，減少了工藝流程，提高了分離效率。
專利保護
《一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產煙醯胺中的套用》所要求保護的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）KR2保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCCNO.3242，保藏日期為2009年8月19日。
技術領域
《一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產煙醯胺中的套用》屬於生物化工領域，涉及一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產煙醯胺中的套用。
權利要求
1.一株枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）KR2，保藏於中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.3242。
2.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）CGMCCNO.3242在生物催化生產煙醯胺中的套用。
3.根據權利要求2所述的套用，其特徵在於利用枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）CGMCCNO.3242生物催化生產煙醯胺的工藝如下：以3-氰基吡啶為底物，以枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）CGMCCNO.3242為生物催化劑，採用底物和生物催化劑耦合補加的方式於5～35℃，100～300轉/分鐘下進行催化水合反應得到煙醯胺。
4.根據權利要求3所述的套用，其特徵在於所述的3-氰基吡啶的起始添加量為1～10％，生物催化劑的起始添加量為1～5％，當底物濃度低於0.5克/升時，開始耦合補加底物3-氰基吡啶和生物催化劑，每批的添加量和兩者的起始添加量一致，順序可以互為先後或同時補加，使得最終底物累加濃度在25％以上，最終生物催化劑累積濃度在1～30％。
5.根據權利要求3所述的套用，其特徵在於所述的底物濃度趨向於零時結束反應。
6.根據權利要求3所述的套用，其特徵在於所述的反應結束後，將反應液在2500～3500轉/分鐘下離心或者用0.2～0.5微米膜超濾後於0～4℃下冷凍結晶、之後於30～80℃下真空乾燥得到純度達98％以上的煙醯胺。
實施方式
- 實施例1：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）CGMCCNO.3242的篩選
從南京第一農藥廠污水池不同角度取污泥樣100餘批，分批富集培養後進行篩選和鑑定：稱取10克污泥，加無菌水50毫升，用玻璃珠搖碎後取5毫升懸濁液接種到45毫升富集培養基中，放置30℃搖床上，120轉/分鐘振盪培養3天。之後取該培養液進行梯度稀釋，取10-6、10-7、10-8的梯度稀釋液塗布到含初篩固體培養基的平板上，置30℃恆溫培養箱培養3～6天。挑取生長出的單菌落接種到新的初篩固體培養基上擴大培養，培養條件同上。待菌長出後刮取3～5環接種到液體發酵培養基中進行培養。在30℃搖床上120轉/分鐘下振盪培養3天，取15毫升培養液3000轉/分鐘下離心10分鐘，倒去上清液後用等體積的生理鹽水沖洗沉澱菌體，繼續離心得菌體。將所得菌體添加到含1％（％：克/100毫升）亞氨基二乙腈的PBS緩衝液中轉化2小時，反應體系中菌體濃度為0.5克/升。取5毫升轉化液3000轉/分鐘下離心10分鐘得上清液，HP升C法分析上清液。如果轉化液含有亞氨基二乙酸則說明該菌對亞氨基二乙腈具有轉化能力，選擇其中亞氨基二乙酸轉化率最高的一株，按《簡明伯傑細菌鑑定手冊》第八版進行鑑定為枯草芽孢桿菌。將該株枯草芽孢桿菌命名為KR2，保藏於中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏號CGMCCNO.3242，保藏日期為2009年8月19日。篩選方法中的所述的液體富集培養基、固體初篩培養基、液體復篩培養基如下：
富集培養基（克/100毫升）：葡萄糖：3，酵母膏：0.5，蛋白腖：0.5，氯化鈉：0.1，磷酸二氫鉀：0.1，磷酸氫二鉀：0.1，硫酸鎂：0.05，pH：7，121℃滅菌20分鐘。
固體初篩培養基（克/100毫升）：葡萄糖：3，亞氨基二乙腈（或丙烯腈、或煙腈、或乳腈、或羥基乙腈）：1，氯化鈉：0.1，磷酸二氫鉀：0.1，磷酸氫二鉀：0.1，硫酸鎂：0.05，瓊脂：2，pH：7，121℃滅菌20分鐘。
液體發酵培養基（克/100毫升）：葡萄糖：3，酵母膏：0.5，蛋白腖：0.5，氯化鈉：0.1，磷酸二氫鉀：0.1，磷酸氫二鉀：0.1，硫酸鎂：0.05，尿素：0.5，pH：7，121℃滅菌20分鐘。
- 實施例2：生物催化劑的製備
將枯草芽孢桿菌KR2（CGMCCNo.3242）斜面菌種接種到液體種子培養基中（葡萄糖：15，酵母膏：5，蛋白腖：5，氯化鈉：2，磷酸二氫鉀：1，磷酸氫二鉀：1，硫酸鎂：0.5，尿素：10，己內醯胺：5，氯化鈷：10ppm，pH7.0，單位：克/升）。在溫度為25℃，轉速為150轉/分鐘下振盪培養48小時即可得枯草芽孢桿菌KR2（CGMCCNo.3242）一級種子液，將該一級種子液按照10％的接種量轉接到裝有同樣成分已滅菌的培養基中繼續進行培養，48小時後可得枯草芽孢桿菌KR2（CGMCCNo.3242）二級種子液。
將枯草芽孢桿菌KR2（CGMCCNo.3242）二級種子液按照10％的接種量接種到35升已滅菌的液體發酵培養基中，（葡萄糖：30，酵母膏：10，蛋白腖：10，氯化鈉：2，磷酸二氫鉀：1，磷酸氫二鉀：1，硫酸鎂：0.5，尿素：10，己內醯胺：5，氯化鈷：10ppm，pH：7，單位：克/升），發酵罐體積為50升，採用通空氣與攪拌聯用的方式控制溶氧不低於10％，通氣量：0.2v/v.分鐘，罐壓：0.03兆帕，溫度：25℃，起始轉速100轉/分鐘，發酵過程中根據發酵液的溶氧水平有步驟的調節，最大轉速不超過400轉/分鐘，發酵72小時後即可製得枯草芽孢桿菌KR2（CGMCCNO.3242）細胞發酵液。
將上述所得的發酵液3000轉/分鐘離心15分鐘所得沉澱即為該發明所需的生物催化劑。
- 實施例3：酶活測定
該實施例採用枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）CGMCCNO.3242的發酵液進行酶活的測定。酶活的定義：在25℃下，1毫升發酵液與1微克3-氰基吡啶催化反應1小時後生成的煙醯胺的微克數，該微克數即為總酶活力單位數。煙醯胺採用液相色譜法進行檢測，檢測參數為：色譜柱：C升C-ODS柱，150毫米×6.0毫米I.D；流動相：乙腈/水/庚烷磺酸鈉/三乙胺（50/450/0.8克/2毫升）（pH3）；流速：1.2毫升/分鐘；柱溫：室溫；檢測波長：UV268納米。在該發明條件下，每毫升發酵液中生物量最高可達47毫克濕菌體，總酶活最高可達1255U。
- 實施例4：煙醯胺的製備
在50升攪拌釜中，先添加30升去離子水，調pH到7.0，溫度為30℃。向反應釜中添加0.6千克3-氰基吡啶，生物催化劑的起始添加量為0.1千克。每隔2小時檢測一次反應液中的3-氰基吡啶濃度，當底物濃度低於0.5克/升後同時開始補加底物和生物催化劑，補加的量與起始量一致，連續補加14次。反應50小時後檢測反應液中的3-氰基吡啶的濃度，當底物濃度趨向於零時即可終止反應。將反應液於3000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液同樣條件下再離心1次，得澄清的上清液。將該上清液4℃下冷凍結晶，等析出大量晶體後將混合液於3000轉/分鐘下冷凍離心10分鐘得晶體，60℃下真空乾燥，最後得純度為98.5％的煙醯胺9.68千克，收率達90.3％。
- 實施例5
該實施例僅改變催化反應的溫度，其餘反應條件與參數均與實施例4保持一致。該實施例將攪拌釜中催化反應的溫度調整為10℃，其餘條件不變。最終得到純度為98.5％的煙醯胺9.76千克，收率達91.1％。
- 實施例6
該實施例除對底物和生物催化劑的補加順序進行了調整外，其他的反應條件和操作方法均與實施例4中的方法保持一致。該實施例的反應參數、底物和生物催化劑起始添加量、補加次數也均與實施例4保持一致。該實施例所述的底物和生物催化劑的補加順序指先添加底物，半小時後再補加生物催化劑，以此類推。最終得到純度為98.6％的煙醯胺9.66千克，收率達90.2％。
- 實施例7
該實施例中3-氰基吡啶的起始添加濃度量為2千克，生物催化劑的起始添加量為0.4千克，每隔5小時檢測一次反應液中的底物濃度，當底物濃度低於0.5克/升後開始補加底物與生物催化劑，補加量與起始添加量一致，連續補加4次。其餘反應條件和操作均與實施例4保持一致。最終得純度為99.1％的煙醯胺10.93千克，收率達92.3％。
榮譽表彰
2019年5月16日，《一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產煙醯胺中的套用》獲得安徽省第六屆專利獎金獎。
