《一種多指標檢測的微流控晶片》是博奧生物集團有限公司和清華大學於2014年3月7日申請的發明專利，該專利的申請號為2014100821662，公布號為CN103831140A，授權公布日為2014年6月4日，發明人是王磊、張國豪、周鑫穎、辛娟、張瑤、林明仙、黃國亮、王璨、邢婉麗、程京；該發明屬於微流控晶片領域以及生物檢測領域。
《一種多指標檢測的微流控晶片》所述微流控晶片包括一底片和與所述底片密封配合的蓋片；所述微流控晶片的中心設有一通孔；所述底片上設有一條或多條波浪形的主通道，每條所述主通道的一端均與設於所述底片上的進樣孔相連通，另一端均與設於所述底片上的排氣孔相連通；所述主通道的波谷遠離所述通孔的方向設定，波峰靠近所述通孔的方向設定；所述主通道的任一波谷通過連線管道與一反應池相連通；所述連線管道上設有緩衝池。該發明的微流控晶片可以通過螢光、濁度、顯色以儀器檢測或肉眼直接觀察，可以在反應過程中實時檢測，也可以在反應結束後檢測。
2016年12月7日，《一種多指標檢測的微流控晶片》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
（概述圖為《一種多指標檢測的微流控晶片》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：一種多指標檢測的微流控晶片
- 公布號：CN103831140A
- 公布日：2014年6月4日
- 申請號：2014100821662
- 申請日：2014年3月7日
- 申請人：博奧生物集團有限公司、清華大學
- 地址：北京市昌平區生命科學園路18號
- 發明人：王磊、張國豪、周鑫穎、辛娟、張瑤、林明仙、黃國亮、王璨、邢婉麗、程京
- Int.Cl.：B01L3/00(2006.01)I
- 代理機構：北京紀凱智慧財產權代理有限公司
- 代理人：關暢、王春霞
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
截至2014年3月，微流控晶片是微全分析系統（Micro Total Analysis Systems，μ-TAS）發展的熱點領域，它是以晶片為操作平台，並通過與生物、化學、藥物篩選等技術的結合，完成包括試劑載入、分離、反應、檢測等在內的整個過程。隨著生物晶片技術的快速發展，微流控晶片在生命科學領域，分析化學和生物醫學領域發揮著愈來愈重要的作用。
為了高效、快速、高通量的檢測樣品，要求晶片具有多組反應孔及向各反應孔輸送樣品的有效輸送方式。一般微流控晶片會藉助電磁場力、離心力等外力作用下將待測樣品輸送至晶片內部。
專利文獻1（CN101609088A）公開了在外部電場的作用下，對帶電液滴施加電場力，控制微粒子在微流體管道中向各個分支區域移動的送流裝置。但是，在該方法中，需要向晶片引入生成電場的複雜機構和設備；又因為輸送液體在電場區域需要先轉換成液滴，並以液滴的方式向指定區域送流，大大降低了樣品的處理速度。
專利文獻2（CN103055973A）公開了利用驅動樣品的電滲泵，將帶電不同的待測物質分離的裝置。但該方法僅適用於必須帶有電荷被測樣品，對一般生物樣品及不帶電荷的樣品不起作用。
專利文獻3（CN102369443A）披露了一種離心式輸液晶片，即液體從晶片中央的存儲部向周圍的各個加樣孔進行離心配送。該主流路的設計，即山部與谷部同寬的主流路的設計仍未能解決各加樣孔配液均勻性的問題；另外谷部比山部過寬的設計，造成加樣過程中主流路有氣泡產生的問題。此外，通過添加廢液室承載過量的溶液，雖在一定程度上實現了各加樣孔分配液體體積的一致性，但並不能保證反應過程中液體始終充滿加樣孔，並且需要在微流體管道內部進行局部表面改性處理，即與加樣孔連線的分支流路內表面的親水處理，與收集剩餘溶液的廢液室相連的分支流路內表面的疏水處理，增加了晶片製造的複雜性，加工成本及加工難度。
因此，2014年3月前面臨的技術性難點在於研發一款在結構與製造上簡便的晶片，不僅實現向各加樣孔精確配液，而且避免鄰近反應池間的交叉污染的問題，從而達到高通量，高靈敏度和高精度的要求。
發明內容
專利目的
《一種多指標檢測的微流控晶片》的目的是提供一種多指標檢測的微流控晶片，該發明採用離心進樣的方式均勻分配待檢測樣品。該發明可以通過限定主通道截面積的比例實現樣品更加均勻的分配；該發明還可以通過緩衝池的設計保障離心分配後反應池內液體全滿，同時還可以保障反應池內液體在整個反應期間保持充滿，且阻止各反應池內的反應產物向主通道及相鄰反應池內擴散。
技術方案
《一種多指標檢測的微流控晶片》所提供的一種多指標檢測的微流控晶片，包括一底片和與所述底片密封配合的蓋片；所述微流控晶片的中心設有一通孔；所述底片上設有一條或多條波浪形的主通道，每條所述主通道的一端均與設於所述底片上的進樣孔相連通，另一端均與設於所述底片上的排氣孔相連通；所述主通道的波谷遠離所述通孔的方向設定，波峰靠近所述通孔的方向設定；所述主通道的任一波谷通過連線管道與一反應池相連通；所述連線管道上設有緩衝池。
上述的微流控晶片中，所述緩衝池的容積為所述反應池的容積的0.2～0.8倍，所述緩衝池設於所述連線管道上，位於所述反應池與所述主通道之間。
上述的微流控晶片中，所述連線管道與所述反應池的連線點位於所述微流控晶片的中心與所述反應池的中心的連線上。
上述的微流控晶片中，在所述底片上，所述主通道呈圓形分布。
上述的微流控晶片中，在所述底片上，所述一條或多條所述主通道可以形成一個或多個圓形。
上述的微流控晶片中，所述反應池的容積為0.1～5微升；且在特定所述反應池內預先裝載有可與待測樣品中某些成分發生特異性反應的物質或材料或是一段核酸序列；
所述主通道的任一V形部分的容積為與其相連通的所述反應池的容積的1.2～1.8倍。
上述的微流控晶片中，所述主通道的最窄處的橫截面積與最寬處的橫截面積的比值為0.2～1；
且當所述比值小於1時，所述主通道的波峰處的橫截面積比波谷處的橫截面積小。
上述的微流控晶片中，所述微流控晶片包括5～100個所述反應池，所述反應池可以分為一組（通過一條所述主通道相連通）或多組（包括多條所述主通道，且不同組的反應池之間不連通）。
上述的微流控晶片中，所述底片與所述蓋片的厚度均優選為0.05～1毫米，如果厚度太薄，則使其容易變形，而且管道深度將受到薄片厚度的影響，使得晶片載入試劑量小；如果薄片太厚，材料的導熱效果將受到影響，使得晶片內部受熱不夠均勻，影響檢測結果；
所述主通道、所述反應池、所述連線管道和所述緩衝池的深度優選為40微米～800微米。
上述的微流控晶片中，所述底片上的進樣孔為圓形，其尺寸恰好可與生物實驗中常規使用的標準Tip頭匹配，操作人員可以使用標準Tip頭直接對準進樣孔進樣；這種進樣孔的設計使得晶片的製造容易實現且方便操作人員使用。
上述的微流控晶片中，所述通孔的內緣處設有一定位缺口，所述定位缺口在離心進樣時起到固定晶片的作用；晶片用儀器檢測時，所述定位缺口起到待測反應池定位的作用。
《一種多指標檢測的微流控晶片》可採用具有所需粘合強度、能夠耐受常規加熱溫度、對所進行的反應性沒有顯著不良影響的雙面膠將所述底片和所述蓋片牢固貼合。
一般情況下，聚合物微流控晶片採用熱壓、雷射焊接等方式將底片與蓋片表面受熱熔融而貼合。這兩種加工方式所用的設備價格昂貴，並且對於該發明所述的需要在底片上預先裝載樣品的晶片，熱壓和雷射焊接的加工過程會對預先裝載樣品的生物活性、化學特性等產生不良影響。另外，這兩種加工方式可能對微流體管道的形狀產生影響，嚴重時甚至造成管道堵塞或晶片漏液。
《一種多指標檢測的微流控晶片》的雙面膠需要具有足夠的粘合強度且耐受生物分析中各種常用加熱條件，防止晶片在受熱使用的情況下開膠漏液，造成測試失敗或環境污染。
《一種多指標檢測的微流控晶片》的雙面膠需具有適當的生物相容性，能夠很好的保持待測樣品和預埋樣品的生物活性以及化學特性，對晶片上所進行的反應不會產生顯著的不良影響。
《一種多指標檢測的微流控晶片》所用雙面膠的光學性質需要與所採用的檢測手段兼容，舉例來說，當採用透過式螢光檢測時，要求該雙面膠對於反應池內所發螢光具有足夠的光學透過性，當採用反射式螢光檢測時，要求該雙面膠在所檢測光學波段的螢光背景要足夠低。
《一種多指標檢測的微流控晶片》所述晶片採用有粘性的封口膜封口。一般產品通常會使用礦物油或矽油等材料通過二次加樣，將初次加入的樣品密封在晶片中。該發明採用具一定粘性的封口膜封口，避免了二次加樣，減輕了操作人員的負擔。
改善效果
使用《一種多指標檢測的微流控晶片》提供的微流控晶片，只要在晶片生產時在不同反應池內預先裝載不同的物質就可以在同一設計的晶片上進行核酸擴增反應、生化反應、免疫反應等多種形式的檢測，或者利用同一種反應形式檢測不同的物質，從而在一種晶片平台上實現多種套用。舉例來說，若要在晶片上通過核酸擴增反應檢測樣品中的特定核酸片段（比如某個突變型基因或病原微生物的基因），可以在不同反應池中預先裝載可與待檢樣品中不同核酸片段發生特異性反應的引物及輔助成分；若要在晶片上通過生化反應檢測樣品中的特定物質或成分（比如血糖或甘油三酯），可以在不同反應池中預先裝載可與待檢樣品中不同物質或成分發生特異性生化反應的物質及輔助成分；若要在晶片上通過免疫反應檢測樣品中的特定成分（比如某種抗原或抗體），可以在不同反應池中預先裝載可與待檢樣品中不同物質或成分發生特異性免疫反應的物質及輔助成分。
該發明的微流控晶片可以通過螢光、濁度、顯色以儀器檢測或肉眼直接觀察，可以在反應過程中實時檢測，也可以在反應結束後檢測。
附圖說明
圖1為《一種多指標檢測的微流控晶片》的俯視圖。
圖2為該發明微流控晶片的剖面圖。
圖3為該發明微流控晶片中未設定緩衝池時的液體離心分配情況。
圖4為該發明微流控晶片中設定緩衝池時的液體的分配情況。
圖5為該發明提供的多份樣品檢測的微流控晶片的俯視圖。
圖6為該發明提供的另一種微流控晶片的俯視圖。
圖7為該發明微流控晶片染料進樣後和離心後的晶片照片。
圖8為該發明微流控晶片中主管道橫截面最窄處與最寬處的比值小於該發明微流控晶片規定範圍0.2：1時的進樣離心實驗照片。
圖9為該發明微流控晶片中進樣孔的示意圖。
圖10為套用該發明微流控晶片測試得到的實時螢光曲線圖。
圖中各標記如下：1底片、2蓋片、3通孔、4主通道、5連線管道、6反應池、7緩衝池、8定位缺口、9進樣孔、10排氣孔。
權利要求
1.《一種多指標檢測的微流控晶片》特徵在於：所述微流控晶片包括一底片和與所述底片密封配合的蓋片；所述微流控晶片的中心設有一通孔；所述底片上設有一條或多條波浪形的主通道，每條所述主通道的一端均與設於所述底片上的進樣孔相連通，另一端均與設於所述底片上的排氣孔相連通；所述主通道的波谷遠離所述通孔的方向設定，波峰靠近所述通孔的方向設定；所述主通道的任一波谷通過連線管道與一反應池相連通；所述主通道的最窄處的橫截面積與最寬處的橫截面積的比值為0.2～1；且當所述比值小於1時，所述主通道的波峰處的橫截面積比波谷處的橫截面積小；所述連線管道上設有緩衝池；所述緩衝池的容積為所述反應池的容積的0.2～0.8倍。
2.根據權利要求1所述的微流控晶片，其特徵在於：所述連線管道與所述反應池的連線點位於所述微流控晶片的中心與所述反應池的中心的連線上。
3.根據權利要求1或2所述的微流控晶片，其特徵在於：在所述底片上，所述主通道呈圓形分布。
4.根據權利要求3所述的微流控晶片，其特徵在於：在所述底片上，一條或多條所述主通道形成一個或多個圓形。
5.根據權利要求1或2所述的微流控晶片，其特徵在於：所述反應池的容積為0.1～5微升；所述主通道的任一V形部分的容積為與其相連通的所述反應池的容積的1.2～1.8倍。
6.根據權利要求1或2所述的微流控晶片，其特徵在於：所述微流控晶片包括5～100個所述反應池。
7.根據權利要求1或2所述的微流控晶片，其特徵在於：所述底片與所述蓋片的厚度均為0.05～1毫米；所述主通道、所述反應池、所述連線管道和所述緩衝池的深度為40微米～800微米。
8.根據權利要求1或2所述的微流控晶片，其特徵在於：所述底片上的進樣孔為圓形；且所述進樣孔的尺寸與Tip頭匹配；所述通孔的內緣處設有一定位缺口。
實施方式
圖1為《一種多指標檢測的微流控晶片》提供的多指標檢測的微流控晶片（96孔）的俯視圖，圖2為該發明微流控晶片的剖面圖。該發明微流控晶片一底片1和與該底片1密封配合的蓋片2，均採用具有所需粘合強度、能夠耐受常規加熱溫度、對所進行的反應性沒有顯著不良影響的雙面膠牢固貼合。在該微流控晶片的中心設有一通孔3，通孔3的內緣處設有定位缺口8，該通孔3和定位缺口8共同起到定位的作用，進而在離心時起到固定和定位作用，僅需要一個離心機即可完成樣品離心分配。在底片1上設有一條波浪形的主通道4，該波浪形的主通道4的一端與設於底片1上的進樣孔9相連通，另一端與設於所述底片1上的排氣孔10相連通，其中進樣孔設計成可與生物實驗中常規使用的標準規格的塑膠Tip頭嚴密匹配的圓形，例如當需要的加樣體積在20～200微升之間時，進樣孔9的直徑可在0.75毫米～0.9毫米之間。
如圖1所示，該波浪形的主通道4的波谷通過連線管道5與反應池6相連通，且反應池6沿遠離通孔3的方向設定，且連線管道5與反應池6的連線中心點位於微流控晶片的中心與反應池6的中心的連線上，以便於旋轉該晶片時主通道4內的液體可以在離心力的作用下通過連線管道5進入反應池6中。
如圖1所示，在底片1上，波浪形的主通道4形成2個圓形。
如圖1所示，在連線管道5上設有緩衝池7，《一種多指標檢測的微流控晶片》對在連線管道5上是否設定緩衝池7的使用效果進行了對比，該發明設定的緩衝池7主要有3個作用：
一、保證微流控晶片在離心進樣時，液體充滿反應池。
當沒有設定緩衝池7且每個反應池6的容積與主通道4的V形部分的容積相同時，在離心分配樣品時由於V形部分液體分配不能達到絕對平均，造成部分反應池進樣不滿，如圖3（a）所示，或者部分反應池分配量過多，在主通道4產生液體殘留，如圖3（c）所示。由此每個反應池內分配的液體量不一致會造成各反應池內的反應結果不一致，直接影響反應結果的準確性。主通道4殘餘的液體導致反應池內的反應產物更加容易向相鄰反應池內擴散，造成交叉污染。圖3（b）為理想情況下，離心後樣品均勻分配示意圖。
當設定有緩衝池7時，使存儲在每個反應池對應V形部分的液體離心後填滿至緩衝池容積的三分之二，這樣可以使離心分配造成的不均勻分配僅體現在緩衝池上，而確保反應池是全滿的，如圖4所示。
二、保證反應池在加熱過程中也能夠保證液體充滿反應池。
如果沒有設定緩衝池，假設即使在離心分配時液體均勻分配到每個反應池內，但是如果反應池內發生的反應需要在一定溫度下進行時，反應池內的液體受熱氣化，造成反應池內液體量減少。液體量的減少使反應池內液體濃度發生變化，而且每個反應池內液體減少量也並不一致。反應液濃度的變化以及反應池液體量的減少都會影響反應結果的準確性。
在連線管道上直接設定緩衝池7後，即使有液體量的損耗，緩衝池內的液體也會向反應池補充，使反應池內液體持續保持全滿狀態。
三、阻止各反應池產物向相鄰反應池擴散而產生交叉污染。
通過實驗觀察，當進樣液體離心分配到反應池以後，在連線管道會有液膜存在，如果相鄰反應池僅通過連線管道相連，那么反應池內的反應物很容易通過液膜擴散至相鄰反應池，導致交叉污染。《一種多指標檢測的微流控晶片》通過在連線管道上直接設定緩衝池成功避免了交叉污染這一問題。根據物質的擴散運動我們知道，物質一般都是從高濃度到低濃度擴散。
當反應池內擴增產物向外擴散時，先進入到緩衝池內，擴散產物濃度在緩衝池中被大大降低，因此減少了擴散產物再向連線管道擴散的幾率，提高了檢測結果的準確性。
如圖5所示，為《一種多指標檢測的微流控晶片》提供的多份樣品檢測的微流控晶片的俯視圖，底片上設有4條波浪形的主通道4，且這4條波浪形的主通道4形成一個圓形，且每條主通道4的一端與進樣孔9相連通，另一端與排氣孔10相連通。在該發明中，與每條主通道4相連的反應池6內分別預先裝載利用同一種反應形式檢測的不同物質，例如可以在不同反應池6中預先裝載可與待測樣品中不同核酸片段發生特異性反應的引物及輔助成分，通過多組樣品的進樣離心且核酸擴增反應，便可在一張晶片上對多組待測樣品中的特定核酸片段進行檢測。
如圖6所示，為《一種多指標檢測的微流控晶片》提供的多指標檢測的微流控晶片的另一種實施方式的俯視圖，波浪形的主通道4形成一個圓形，且該主通道4的波峰處的橫截面積比波谷處的橫截面積小。在該發明中，優選主通道4的V形部分的最窄處的橫截面積與最寬處的橫截面積的比值為0.2～1，經實驗驗證，若該比值小於0.2，則串聯貫通形成的V形主通道內阻力大、發生進樣困難的問題，同時由於波谷區域的面積相對波峰面積過寬，進樣時容易產生氣泡且分配液體不均勻；另外，若該比值大於1，則易導致離心分配時各反應池有配液不均勻的問題。實驗驗證結果如下：
如圖7所示，為實驗組（比值為0.3:1）晶片染料進樣後和離心後的晶片照片；圖8為對照組（主通道最窄處的橫截面積與最寬處的橫截面積的比值小於0.2）晶片染料進樣後和離心後的晶片照片。
可以觀察到，圖7中，在進樣過程中無氣泡產生且離心後各反應池配液均勻；圖8中，對照組進樣時、與個別反應池對應的V形主通道內觀察到有氣泡產生，離心分配時、可以明顯觀察到液體向各個反應池分配不均勻。
在《一種多指標檢測的微流控晶片》的微流控晶片中，加樣孔設定在0.05～1毫米厚度範圍內的底片1上，當加樣孔的直徑設定在0.75～0.9毫米範圍時，可以用生物實驗中常規使用的標準的200微升Tip頭實現直接嚴密加樣，不會造成加樣過程中的漏液。如圖9所示，槍頭尖端的直徑尺寸0.75毫米，距離尖端1毫米處其直徑為0.9毫米。所以當加樣孔直徑小於0.75毫米時將無法將槍頭插入，當直徑大於0.9毫米時，槍頭與加樣孔側壁存在間隙，加樣時會有漏液。所以加樣孔最優設計尺寸應在0.75-0.9毫米之間，若設計尺寸0.75毫米，Tip頭無法插入至加樣孔，加樣時易漏液，如圖9（a）；若設計尺寸0.9毫米時，Tip頭需要完全插入進樣孔，加樣時Tip頭連線埠與晶片低端貼合，易堵塞管道造成進樣困難，如圖9（b）。該發明晶片的加樣孔設計為直徑0.8毫米，Tip頭插入後其尖端與晶片低端有一定間隙，如圖9（c），通過大量實驗驗證，能夠方便、無漏液的將移液器內樣品準確加入到晶片的主通道4內。
《一種多指標檢測的微流控晶片》提供的微流控晶片，可以開發多種套用，進行多種反應，例如：核酸擴增反應、生化反應、免疫反應等。下面以恆溫擴增反應為例，說明其使用過程。
在《一種多指標檢測的微流控晶片》的晶片平台上，結合公司開發恆溫擴增試劑盒以及RTisochip-A恆溫擴增微流控晶片核酸分析儀，可以實現病菌基因的恆溫擴增反應，以及病菌檢測。其檢測原理是採用恆溫擴增技術，利用具有鏈置換功能的聚合酶在恆溫（比如65℃）條件下進行反應，利用螢光染料摻入法進行實時螢光檢測，擴增陽性的樣品會產生類似實時螢光恆溫的“S”形擴增曲線，一步完成對靶基因的擴增和檢測。該發明的特點是將上述恆溫擴增方法與微流體晶片技術相結合，可同時對多種核酸靶序列進行高通量並行檢測。
具體流程如下：
每張晶片上設有24個反應池，並在特定反應池包埋固定一套引物用於一種核酸靶序列的擴增與檢測。該晶片24個反應池，設定兩個反應池分別包埋陰、陽對照品，其餘22個反應池可以包埋22種不同的核酸靶序列，即在該版晶片上可以同時檢測22種病菌。
將待測樣品DNA與擴增試劑混合後注入晶片。待檢測樣品可以是病人的痰液、口腔試子、血液等，使用博奧生物集團有限公司的晶芯®通用型細菌DNA快速提取試劑盒進行DNA提取。
加樣後進出樣口周圍若有溶液殘留，用吸水紙輕輕擦去，然後取1張封口膜，覆蓋於進出樣口上。
加樣後的晶片放入RTisochipTM-A恆溫擴增微流控晶片核酸分析儀內，完成擴增反應。晶片上的各個反應池內同時進行獨立的恆溫擴增反應，並通過恆溫擴增儀器完成實時螢光檢測，若檢測到某反應池出現“S”形擴增曲線，則該反應池對應的檢測指標為陽性，圖10為晶片實時螢光檢測結果。
榮譽表彰
2016年12月7日，《一種多指標檢測的微流控晶片》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
