一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用:專利背景,發明內容,專利目的,解決方

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》是中國農業科學院飼料研究所於2008年12月9日申請的專利，該專利的公布號為CN101748108A，授權公布日為2010年6月23日，發明人是姚斌、羅會穎、王亞茹、楊培龍、孟昆、史秀雲、柏映國、袁鐵錚、石鵬君、楊君。

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用。該發明提供了一種來源於嗜酸雙孢菌屬Bispora sp.的葡聚糖酶GLU7A，其胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且該發明提供了編碼上述葡聚糖酶的基因組和cDNA編碼基因glu7A。該發明獲得一種嗜酸葡聚糖酶，其最適pH值為1.5-5.0，同時在酸性環境中均保持有高的酶活性，其抗蛋白酶水解。且該酶不僅水解β-1，3-1，4-葡聚糖，還能水解纖維素。這些性質使其能套用於食品、飼料和啤酒工業中。

2018年12月20日，《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》獲得第二十屆中國專利獎優秀獎。

基本介紹

公告號：CN101748108A
授權日：2010年6月23日
申請號：2008102393090
申請日：2008年12月9日
申請人：中國農業科學院飼料研究所
地址：北京市海淀區中關村南大街12號
發明人：姚斌、羅會穎、王亞茹、楊培龍、孟昆、史秀雲、柏映國、袁鐵錚、石鵬君、楊君
Int.Cl.：C12N9/42(2006.01)I; C12N15/56(2006.01)I; C12N15/63(2006.01)I; C12N1/21(2006.01)I; C12N1/19(2006.01)I
代理機構：北京法思騰智慧財產權代理有限公司
代理人：楊小蓉
類別：發明專利
生物保藏：CGMCC No.2500 2008.05.19

專利背景,發明內容,專利目的,解決方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,實驗條件,實施案例,序列表,榮譽表彰,

專利背景

β-葡聚糖是禾本科高等植物細胞壁中的結構性非澱粉多糖，在穀物（大麥、燕麥、高粱、大米和小麥）的胚乳細胞壁中含量尤其豐富。

β-葡聚糖是由D型β構象葡萄糖連線的多糖聚合物，具有線型的空間結構。依據糖苷鍵連線的不同，β-葡聚糖可以分為1，4-β-葡聚糖，1，3-β-葡聚糖，1，6-β-葡聚糖，1，3-1，6-β-葡聚糖，1，3-1，4-β-葡聚糖等。其中1，3-1，4-β-葡聚糖是由β-1，3和β-1，4混合的糖苷鍵連線，通常是由β-1，4糖苷鍵連線葡萄糖形成纖維三糖或纖維四糖，再由β-1，3鍵相互連線成直鏈多聚體形式。在大麥和燕麥等澱粉胚乳的細胞壁中含量在70％左右。

當含有β-葡聚糖的穀物用作飼料原料時，β-葡聚糖是重要的抗營養因子。β-葡聚糖包括水溶性和非水溶性兩類，單胃動物腸道中不能分泌相關的酶消化分解β-葡聚糖。並且，水溶性葡聚糖可以增大食糜的粘性，減少動物消化酶與營養物質的接觸，降低消化養分的吸收；食糜粘性增加還造成畜禽糞便含水量和粘稠度增加，影響畜禽舍周圍環境；β-葡聚糖可以結合、吸附金屬離子、有機質等營養物質，造成其代謝受阻；還能降低其他消化酶的活力，影響脂肪和蛋白質的消化吸收。

β-葡聚糖酶是能分解β-糖苷鍵鏈成葡萄糖聚合物的一類酶的總稱。按作用方式不同，β-葡聚糖酶可分為內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶兩類。其中內切β-1，3-1，4-葡聚糖酶（酶學分類號E.C.3.2.1.73）可以水解β-1，3-1，4-葡聚糖，專一作用於與β-1，3鍵相連的β-1，4糖苷鍵，使其降解為低分子量片段，失去親水性和粘性。從而改變單胃動物腸道內容物的特性，提高內源性消化酶活性，改變腸道微生物環境，利於動物對營養物質的消化和吸收，提高生長性能和飼料的轉化率（MathlouthiNetal.AminRes，2002，51：395-406.），在食品和飼料工業等方面有廣闊的套用前景。

植物和微生物都能產生β-1，3-1，4-葡聚糖酶，在植物種子發芽過程中可以由糊粉層和盾片分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶以分解胚乳細胞壁中的β-葡聚糖。生產中套用較多的是微生物所產的β-1，3-1，4-葡聚糖酶，包括細菌（主要為芽孢桿菌）、真菌和瘤胃微生物。目前已經有多種不同來源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因被克隆和表達。包括芽孢桿菌Bacillus sublitis（Hinchliff E et al.Curr Genet，1995，8：471-475.）、B.amyloliquefaciens、B.circulans（Kim JY et al.Biotechnol Lett，2003，25：1445-1449.）、B.licheniformis（Lloberas J et al.Eur J Biochem，1991，

197 ：337-343.）、B.brevis、類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa（Gosalbes MJ et al.JBacteriol，1991，173（23）：7705-7710.）、P.macerans（Borris R et al.Mol Gen Genet，1990，222：278-283.）。它們所產的β-1，3-1，4-葡聚糖酶都具有相似的核苷酸和胺基酸序列，並且都有一個保守的胺基酸序列EIDIEF，其中的兩個谷氨酸殘基參與酶的水解（Hahn M et al.J Biol Chem，1995，270 ：3081-3088.）。在一些非芽孢桿菌的細菌中也克隆到β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，例如熱纖梭菌Clostridium thermocellum（Schimming Set al.Biochem Biophys Res Commun，1991，177 ：447-452.）、牛鏈球菌Streptococcusbovis（Ekinci MS et al.Appl Environ Microbiol.1997，63 ：3752-3756.）、產琥珀酸絲狀桿菌菌Fibrobacter succinogenes（Chen JL et al.J Biol Chem，2001，276 ：17895-17901.），在厭氧真菌Orpinomyces中分離的β-1，3-1，4-葡聚糖酶序列與芽孢桿菌也很相似（Chen Het al.Journal of Bacteriology1997，179 ：6028-6034.）。

不同來源的基因可以在不同的載體和寄主系統中得到表達，包括大腸桿菌（Escherichia coli），芽孢桿菌，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以及轉基因大麥和菸草等，但不同表達系統的葡聚糖酶活性有較大的差異。

然而，獲得新型具有優良特性葡聚糖酶的研究仍具有重大意義。克隆和分離具有高比活、良好穩定性和底物特異性的葡聚糖酶可以更好的套用於飼料和啤酒工業，而較高的表達量可以降低生產成本，都是葡聚糖酶套用於工業必需的。

發明內容

專利目的

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》的目的是提供一種能高效套用的嗜酸葡聚糖酶。

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》的再一目的是提供編碼上述嗜酸葡聚糖酶的基因。

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》的另一目的是提供一種製備上述嗜酸葡聚糖酶的基因工程方法。

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》的另一目的提供上述嗜酸葡聚糖酶的套用。

解決方案

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》提供了一種嗜酸葡聚糖酶GLU7A，其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示。

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》提供了編碼上述嗜酸葡聚糖酶的基因glu7A。具體地，該基因的基因組序列如SEQIDNO.2所示。其cDNA序列如SEQIDNO.3所示。

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》還提供了包含上述嗜酸葡聚糖酶基因glu7A的重組載體，優選為pPIC-glu7A。[0018]《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》還提供了包含上述嗜酸葡聚糖酶基因glu7A的重組菌株，優選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》還提供了一種製備嗜酸葡聚糖酶GLU7A的方法，包括以下步驟：

1）用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；

2）培養重組菌株，誘導重組葡聚糖酶表達；以及

3）回收並純化所表達的葡聚糖酶GLU7A。

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》還提供了上述嗜酸葡聚糖酶GLU7A的套用。

改善效果

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》獲得一種嗜酸葡聚糖酶GLU7A，其最適pH值為1.5-5.0，同時在酸性的範圍內均具有高的酶活穩定性。該酶具有較好的底物適應性，不僅可以水解β-1，3-1，4-葡聚糖，還能水解纖維素、木聚糖等。這些性質符合動物消化生理特點、pH適應範圍提高飼料消化能和代謝能，降低配方成本，減少環境污染；提高穀物加工副產品的營養價值，提升飼料產品品質。本葡聚糖酶可套用於釀酒工業，降低物料粘度，可以有利於澱粉酶作用於澱粉層，提高澱粉利用率，增加酒精的產率。

附圖說明

圖1在畢赤酵母菌中表達的重組葡聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1：低分子量蛋白質Marker；2：含有葡聚糖酶基因的畢赤酵母菌培養上清液濃縮液；3：含有葡聚糖酶的膜包濃縮的上清液4：純化的重組葡聚糖酶。

圖2重組葡聚糖酶的最適pH。

圖3重組葡聚糖酶的pH穩定性。

圖4重組葡聚糖酶的最適溫度。

圖5重組葡聚糖酶的熱穩定性。

圖6重組葡聚糖酶的蛋白酶抗性。

嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1，於2008年5月19日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101），其保藏號為：CGMCCNo.2500。

技術領域

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》涉及基因工程領域，具體地，《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》涉及一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因、包含該基因的重組載體和套用。

權利要求

1.一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.一種嗜酸β-葡聚糖酶基因glu7A，其特徵在於，編碼權利要求1所述的嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A。

3.如權利要求2所述的嗜酸β-葡聚糖酶基因glu7A，其特徵在於，其鹼基序列如SEQIDNO.2所示。

4.如權利要求2所述的嗜酸β-葡聚糖酶基因glu7A，其特徵在於，其鹼基序列如SEQIDNO.3所示。

5.包含權利要求2、3或4所述嗜酸β-葡聚糖酶基因glu7A的重組載體。

6.包含權利要求2、3或4所述嗜酸β-葡聚糖酶基因glu7A的重組載體pPIC-glu7A，其特徵在於，通過將所述基因glu7A經EcoRI和NotI酶切後，再與表達載體pPIC9連線而製備所述重組載體pPIC-glu7A。

7.包含權利要求2、3或4所述嗜酸β-葡聚糖酶基因glu7A的重組菌株。

8.如權利要求7的重組菌株，其特徵在於，所述菌株為大腸桿菌（Escherichiacoli）、酵母菌（yeastcell）、芽孢桿菌（Bacilluscell）或乳酸桿菌（Lactobacilluscell）。

9.一種製備嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A的方法，其特徵在於，包括以下步驟：1）用權利要求5的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2）培養重組菌株，誘導重組葡聚糖酶表達；以及3）回收並純化所表達的β-葡聚糖酶GLU7A。

10.權利要求1所述嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A在飼料和啤酒工業中的套用。

實施方式

實驗條件

1、菌株及載體：

2、酶類及其他生化試劑：內切酶購自TaKaRa公司，連線酶購自Invitrogen公司。底物購自Sigma公司，其它都為國產試劑。

3.培養基：Bisporasp.MEY-1培養基為馬鈴薯汁培養基：1000毫升馬鈴薯汁，10g葡萄糖，25g瓊脂，pH2.5。

《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》中所用到重組遺傳學技術均為該領域中的常規技術。在以下實施例中未作詳細介紹的技術，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關章節或部分來進行，包括：Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual（第3版.2001）；Kriegler，Gene Transferand Expression ：A Laboratory Manual（1990）；和 Current Protocols in MolecularBiology（Ausubel 等人編，1994）。

實施案例

實施例1、嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1及其產酶特性

將來源於江西某礦的鈾礦廢水樣品經馬鈴薯汁培養基培養後，塗布於產酶培養基（（NH4）2SO45克/升，KH2PO41克/升，MgSO4·7H2O0.5克/升，FeSO4·7H2O0.01克/升，CaCl20.2克/升，葡聚糖1％，1.5％瓊脂糖，pH2.5）平板上，30℃培養5～6d，在產酶培養基平板可見透明圈產生。證明其具有葡聚糖酶活性。

實施例2、嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1葡聚糖酶編碼基因glu7A的克隆

提取嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1基因組DNA：

將液體培養3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2毫升提取液，研磨5分鐘，然後將研磨液置於50毫升離心管中，65℃水浴鍋裂解20分鐘，每隔10分鐘混勻一次，在4℃下10000轉每分離心5分鐘。取上清於酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，於室溫靜置5分鐘後，4℃下10000轉每分離心10分鐘。棄上清，沉澱用70％的乙醇洗滌兩次，真空乾燥，加入適量TE溶解，置於-20℃備用。

根據葡聚糖酶基因的保守序列設計合成了簡併引物P1：5′-ggYTACTgYgAYgCNCARTg-3′；和P2：5′-TAgggRTTgAANCCRCANCC-3′。以嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應參數為：94℃變性3分鐘；然後94℃變性30sec，46℃退火30sec，72℃延伸1分鐘，32個循環後72℃保溫10分鐘。得到一約280bp片段，將該片段回收後與pEASY-T3載體相連測序。

根據測序得到的核甘酸序列，設計上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物：設計方向為需要擴增的未知區域方向，sp2的位置設計在sp1的內側，sp3位於sp2的內側。每兩個引物之間的距離沒有嚴格規定，引物長度一般22～30nt，退火溫度在60～65℃。並將它們分別命名為usp1，usp2，usp3（上游特異性引物），dsp1，dsp2，dsp3（下游特異性引物）見表1。

表1.葡聚糖酶編碼基因glu7ATAIL-PCR特異性引物

通過TAIL-PCR得到已知基因序列的側翼序列，擴增得到產物回收後送三博生物技術有限公司測序。結果獲得全長1341bp的基因。

實施例3、葡聚糖酶基因的RT-PCR分析

提取Bispora sp.MEY-1的總RNA，利用反轉錄酶得到cDNA的一條鏈，然後設計恰當的引物（glu7AF：5′-ATGGCAGTGTTCACTCTGACCGTGG-3′，glu7AR：5′-CTAATTCCAACCGCCAGAGCC-3′）擴增該單鏈cDNA，獲得編碼葡聚糖酶的cDNA序列，擴增得到產物回收後測序。

通過比較葡聚糖酶glu7A的基因組序列和cDNA序列後發現該基因有1個60bp內含子，cDNA全長1281bp，編碼427胺基酸，N端前19個胺基酸為可能的信號肽序列。BLAST比對結果表明，其與Aspergillusoryzae來源的endo-1，4-beta-glucanase的序列相似性最高。胺基酸最高相似性為58％；核苷酸最高相似性為60.3％。證明從Bisporasp.MEY-1中分離克隆得到的編碼葡聚糖酶的基因為新基因。

實施例4、重組葡聚糖酶的製備

將表達載體pPIC9進行雙酶切（EcoRI+NotI），同時將編碼葡聚糖酶的基因glu7A雙酶切（EcoRI+NotI），切出編碼成熟葡聚糖酶的基因片段與表達載體pPIC9連線，獲得含有Bisporasp.MEY-1葡聚糖酶基因glu7A的重組質粒pPIC-glu7A並轉化畢赤酵母GS115，獲得重組畢赤酵母菌株GS115/glu7A。

取含有重組質粒的GS115菌株，接種於400毫升BMGY培養液中，30℃250轉每分振盪培養48h後，離心收集菌體。然後於200毫升BMMY培養基重懸，30℃250轉每分振盪培養。誘導48h後，離心收集上清。測定葡聚糖酶的活力。重組葡聚糖酶的表達量為95U/毫升。SDS-PAGE結果（圖1）表明，重組葡聚糖酶在畢赤酵母中得到了表達。

將培養液10000轉每分離心10分鐘除去菌體，取上清液作為粗酶液，將粗酶液置於冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至80％，13000轉每分離心20分鐘，取沉澱，用緩衝液重新溶解，得到濃縮酶液，進一步用HPLC（AKTA FPLC，Pharmacia公司）純化。經硫酸銨沉澱後上HiTrap_Q_Sepharose_XL（Amersham Pharmacia Biotech預裝柱）陰離子柱。加樣2毫升，先用pH8.0，0.02摩爾/升的Tris-HCl緩衝溶液洗脫平衡柱子，然後用相同緩衝液配製的0～0.6摩爾/升NaCl梯度洗脫10個柱床（約50毫升），流速為5毫升/分鐘，分部收集，每管1毫升。然後對收集管中的溶液測酶活及蛋白電泳分析。圖1顯示得到了電泳純β-葡聚糖酶。所表達的葡聚糖酶經過純化之後，其蛋白質的含量達到總蛋白的90％以上。

實施例5、β-葡聚糖酶的酶活性測定

酶學測定採用國際通用的DNS（3，5-二硝基水楊酸）法，將0.45毫升1％的可溶性地衣多糖（Sigma公司）或其他底物溶液加入試管，放入60℃水浴中預熱3分鐘。再將0.05毫升已經稀釋好的酶液加入到試管中，繼續在60℃水浴中反應10分鐘，向試管中加入2毫升DNS試劑終止反應，將試管在沸水中加熱5分鐘，立即用流水冷卻到室溫，顯色，室溫下放置10分鐘，540nm處測吸光值。對照為先將0.05毫升酶液加入到0.2毫升檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液中，在100℃沸水中煮20分鐘滅活，再加入同體積的底物保溫。

β-葡聚糖酶活性單位定義：在一定條件下，每分鐘分解葡聚糖生成1微摩爾還原糖所需的酶量為1個活性單位（U）。

實施例6、重組β-葡聚糖酶的酶學性質分析

將實施例4所純化的β-葡聚糖酶在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。所用緩衝液為pH1.0-3.5的HCl-Gly緩衝液，pH2.2～8.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉系列緩衝液及pH8.0～10.0Tris-HCl系列緩衝液。純化的β-葡聚糖酶在不同pH的緩衝體系，37℃下測定的pH適性結果（圖2）表明：GLU7A的最適pH為1.5和5.0。將酶液在不同pH值的緩衝液中於37℃下處理30分鐘，再測定酶活性以研究酶的pH穩定性。結果表明（圖3），在pH1.0～8.0之間保持最適pH下酶活的80％以上，這說明此酶具有較好的pH穩定性。

最適溫度的測定在檸檬酸-磷酸氫二鈉（pH5.0）緩衝體系及不同溫度下進行酶促反應。耐溫性測定為在不同溫度下處理30分鐘，再進行酶活測定。酶反應最適溫度測定結果（圖4）表明，GLU7A最適溫度為60℃。酶的熱穩定性試驗表明（圖5），在60℃下保溫45分鐘，活性沒有損失。在70℃下保溫2分鐘，剩餘酶活性為80％左右。說明此酶具有較好的耐熱性。

在β-葡聚糖酶溶液中加入0.05毫升胰蛋白酶（0.1毫克/毫升，用pH7.0、Tris-HCl緩衝液配製），和胃蛋白酶（0.1毫克/毫升，用pH2.0、甘氨酸-HCl緩衝液配製）於37℃處理60分鐘，稀釋後再測定酶活性。用蛋白酶分別處理60分鐘後，剩餘100％的酶活性（圖6）。說明β-葡聚糖酶具有較好的抗蛋白酶水解的能力。

實施例7、該發明β-葡聚糖酶的底物特異性

將不同的底物用檸檬酸-磷酸氫二鈉（pH6.5）緩衝液溶解濃度為0.5％。在酶反應最適溫度和最適pH值下，測定《一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用》β-葡聚糖酶對不同底物的作用。結果表明，本發明β-葡聚糖酶可作用於由β-1，3-1，4葡萄糖苷鍵連線的大麥葡聚糖、地衣多糖，和β-1，4葡萄糖苷鍵連線的甲基纖維素，且對β-1，3葡萄糖苷鍵連線的昆布多糖和木聚糖也具有水解能力。說明該酶具有多功能活性。

表2該發明β-葡聚糖酶的底物特異性

序列表

<110>中國農業科學院飼料研究所

<120>一種嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和套用

<160>3

<210>1

<211>426

<212>PRT

<213>嗜酸真菌（Bispora sp.MEY-1）

<400>1

MAVFTLTVAI ITIIRFASSQ QIGRIPEVHP RLTTQTCTKH GCTTQQTSLV

LDALSHPIDD 60

IHTNESCETS SGGVNTTICP TVEVCAENCA LEGVNYASHG VYTNGDSVTL

RQYLNIDGTE 120

EEVSPRVYLL DPSGRDYEIL KLLNQEISFT VDVSNLPCGM NGALYLTSMD

ASGGRSQLNP 180

AGATYGTGYC DAQCNAPAWI NGVANLKGLG ACCSEMDLWE ANSEATQLTP

HACNVTGFYE 240

CSGAACGSNG VCDKDGCGFN PYGLGDHSFY GPSVTDTIDT KKPFTVVTQF

LTSDGTSTGT 300

LSQIRRLYLQ NGKVIQNAKV DFDNSTLDSI TPAYCEATAA TFEAEGGFPQ

MGKALEMGMV 360

LIFSIWNDPS AFMNWLDSGT AGPCNSTQGN PALIEAENPG TSVTFSNIKW

GDIGTTYSGS 420

GSGGWN 426

<210>2

<211>1341

<212>DNA

<213> 嗜酸真菌（Bispora sp.MEY-1）

<400>2

atggcagtgt tcactctgac cgtggctatt ataacgatca tccggtttgc ctcttctcag 60

cagattggtc gcataccaga agttcatcca aggctcacca cacagacgtg caccaagcac 120

ggttgcacga ctcaacagac ttctctagtc cttgatgcac tttctcatcc gatcgacgat 180

atccatacca acgagtcatg cgagacgtct agtggtggag taaacaccac aatttgccca 240

acggttgaag tctgcgcaga aaattgtgct ctcgagggtg tcaattatgc ctctcatggt 300

gtttacacga atggagattc agtgactctg cgccagtatc ttaatataga tggaaccgaa 360

gaagaagtgt cgccacgcgt ctatcttctt gatccaagcg gcagggatta tgaaatcctg 420

aagctgctca accaggagat tagttttaca gtcgatgttt ctaacctgcc ttgtggaatg 480

aacggagctc tgtaccttac gtctatggat gcttcgggag gccgcagtca gttaaatcct 540

gctggggcaa cttatggcac aggctactgt gatgctcaat gcaatgcccc agcttggatc 600

aacggtgttg caaacttgaa aggccttggt gcatgctgca gtgaaatggt ccgtcgccaa 660

atatattatg agcaagattt gaaatgaggc tgatatctac tatcacagga tctttgggag 720

gctaactctg aagcaaccca actcacccct catgcttgca acgtcactgg cttctatgaa 780

tgttctgggg ctgcatgtgg aagcaacgga gtgtgcgaca aggatggctg cggcttcaat 840

ccttatggcc ttggcgatca ctcattctac ggtcctagtg taacagatac gatcgacact 900

aagaagccct ttactgttgt cactcaattt ttgacctcgg atggaacgtc cacgggcacc 960

ttaagccaga tccgccgatt atatctacag aacggtaagg ttatccagaa tgcgaaggtc 1020

gactttgaca attcgactct ggacagcatt actcctgctt actgcgaggc tacggctgcc 1080

acttttgaag ccgaaggtgg gttcccacag atgggaaaag cactagaaat gggcatggtc 1140

cttattttca gtatctggaa tgatcccagc gccttcatga actggcttga cagcggaacg 1200

gcgggacctt gtaacagtac tcaaggcaac ccagcactaa tcgaagcaga gaaccccgga 1260

actagtgtta ccttctcaaa tatcaagtgg ggagatattg gaacaaccta ctctggctct 1320

ggctctggcg gttggaatta g 1341

<210>3

<211>1281

<212>DNA

<213> 嗜酸真菌（Bispora sp.MEY-1）

<400>3