《一種具有誘導基因表達的骨生物修複製劑的製備方法》是胡方於2014年3月20日申請的發明專利，該專利的申請號為2014101043288，公布號為CN104013993A，公布日為2014年9月3日，發明人是胡方。
《一種具有誘導基因表達的骨生物修複製劑的製備方法》製得的生物材料可用於製造生物骨修復牙膏、組織工程再生、創傷修復醫用材料等。特別是在：組織工程骨、周圍神經、血管、肌腱、體外人工肝人工腎裝置、組織工程口腔黏膜，骨修復材料，預防齲齒、牙齒鬆動、牙齦出血、牙齒修復，創傷修復等方面的有著重大的科學價值和意義，為人類組織再生工程作出重大貢獻。
2018年12月20日，《一種具有誘導基因表達的骨生物修複製劑的製備方法》獲得第二十屆中國專利銀獎。
（概述圖為《一種具有誘導基因表達的骨生物修複製劑的製備方法》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：一種具有誘導基因表達的骨生物修複製劑的製備方法
- 公布號：CN104013993A
- 公布日：2014年9月3日
- 申請日：2014年3月20日
- 申請人：胡方
- 地址：北京市海淀區西三環72號世紀經貿大廈B2308
- 發明人：胡方
- 分類號：A61L27/12（2006.01）I、A61L27/02（2006.01）I、A61L27/54（2006.01）I、A61K8/24（2006.01）I、A61K8/25（2006.01）I等
- 申請號：2014101043288
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
一、牙膏市場：
截至2014年3月，中國牙膏市場中，每年中國共生產牙膏約80億標準支（65克包裝），實現總產值140億元。中國牙膏的市場容量應在220億元至240億元之間，還有近1/3的功能性牙膏市場沒開發。
牙膏的類型不外乎這四大類：脫敏牙膏，爭對牙齒敏感的人群；第二類：防齲齒，兒童面臨酸性飲食環境，對蛀牙的傷害。第三類：藥物類牙膏，針對牙周炎等不同的病狀；簡單止血功能，無法修復受損牙齒部分。第四類：是美白、清新口氣，只起到清潔作用。
中國人口老齡化嚴重，牙齒鬆動、牙齦出血等口腔疾病比較普遍；兒童防蛀，主要加入含氟牙膏，在地中海性質區域，造成大量氟斑牙。
二、組織工程套用：
2014年3月前組織工程套用主要出現：合成材料，高分子人工合成材料PLAPGAPLGA，鈣磷類人工合成陶瓷材料TCPHAPCPCBGC，複合材料PLA+HAP/TCP/CPC等生物材料的研究。
創傷市場2014年3月前主要靠以豬皮為原料，製造人工植皮技術，有生物免疫原性的副作用。骨修復材料，主要來源有同種異體骨，人工骨等材料。遠遠無法滿足醫學發展的需要。
發明內容
專利目的
《一種具有誘導基因表達的骨生物修複製劑的製備方法》涉及一種具有誘導基因表達的生物修複製劑的製備方法。該產品可用於製造生物骨修復牙膏、組織工程再生、創傷修復醫用材料等。可廣泛的套用在：組織工程骨、周圍神經、血管、肌腱、體外人工肝人工腎裝置、組織工程口腔黏膜，骨修復材料，預防齲齒、牙齒鬆動、牙齦出血、牙齒修復，創傷修復等方面的廣泛套用。
技術方案
《一種具有誘導基因表達的骨生物修複製劑的製備方法》的製劑的製備方法包括如下步驟：
（1）製備氧化鈣：取石灰石在鉑金罐中密封，在1900℃的條件下高溫煅燒，冷卻後經粉碎成為10-20納米的CaO粉末；
（2）生成具有生物活性的羥基磷灰石：取規格為10-20納米的CaO和P2O5納米粉末，按照質量比1:1.67混合均勻（500克），在36-38℃的情況下，無光條件下陳化至少12小時；加入醫用純淨水500克攪拌成糊狀，隨後加入Na2O2（3克）38℃下攪拌45分鐘，過10-20目篩，得到粒徑為10-20納米的羥基磷灰石Ca10（PO4）6（OH）2（HA）；
（3）向步驟（2）所得羥基磷灰石中加入SiO2（5克）混合均勻後，在-15～-20℃下凍乾機冷凍乾燥成粉末，並加入醫用甘油10克、醫用聚乙二醇10克、醫用級鈦白粉3克、香精1克、卡波姆2-3克、AK糖3克和十二烷基硫酸鈉2克，均勻混合；
（4）滅菌：將步驟（3）混合所得膏狀體在10℃條件下，輻照滅菌2小時；
（5）乾燥：將步驟（4）所得生物製劑，在-15℃條件下凍乾成固體狀；
（6）粉碎：將該固體粉碎成為20納米的粉末狀。
（7）包裝：將滅菌膏體灌裝在無菌低密度聚乙烯管內，每管質量為60克。
其中，SiO2與Ca10（PO4）6（OH）2形成具有三維網狀生物多孔結構的無機礦物質。SiO2與Ca10（PO4）6（OH）2與唾液中的H2O發生迅速的反應，PH值在7.5左右，合成具有誘導基因表達能力的羥基磷灰石。釋放Ca離子和P離子，從而補充損傷骨結構礦物質，產生沉積在受損骨創面之上和之內的穩定的結晶狀羥基磷酸鹽灰石層（礦化），促使骨組織生長，抑制和殺滅細菌，誘導新的新生組織形成，同時殺菌等作用也能有效緩解創傷發炎腫脹等症狀。
誘導基因表達能力：普通的羥基磷灰石僅僅可以修復，不具有誘導基因表達能力，細胞組織不能有序排列。而該發明的材料形成無水無機礦物，該礦物質具有三維的網狀多孔結構，其深入損傷部分深處的細胞和毛細血管沿著與人體骨骼和組織相一致的孔裝結構中，有序生長，再生細胞爬行在三維網狀結構中。讓新生組織有序的排列，具有基因的表達的能力。
生物降解，爬行替代：該發明的材料在組織再生後，原三維多孔結構無機礦物質。新生組織在30日內，逐步爬行替代原結晶礦物質，原結晶礦物質降解為二氧化碳和水，隨毛細血管排出。其新生組織恢復為原有形狀。
改善效果
《一種具有誘導基因表達的骨生物修複製劑的製備方法》的材料可用於製造生物骨修復牙膏、組織工程再生、創傷修復醫用材料等。特別是在：組織工程骨、周圍神經、血管、肌腱、體外人工肝人工腎裝置、組織工程口腔黏膜，骨修復材料，預防齲齒、牙齒鬆動、牙齦出血、牙齒修復，創傷修復等方面的有著重大的科學價值和意義，為人類組織再生工程作出重大貢獻。
附圖說明
圖1是X射線下的新生羥基磷灰石成像圖。
圖2是牙齒骨修復後的效果圖。
圖3是骨修復效果圖。其形成的三維多孔網狀結構，和人體結構基本一致。
圖4是骨關節軟組織的修復效果圖。
圖5是對軟組織的修復作用。其中，誘導組為使用該發明的產品的結果圖。
技術領域
該發明涉及一種具有誘導基因表達的生物修複製劑的製備方法，特別涉及一種長期持續使用可解決骨修復等問題的生物活性製劑。該發明的產品可用於製造生物骨修復牙膏、組織工程再生、創傷修復醫用材料等。可廣泛的套用在：組織工程骨、周圍神經、血管、肌腱、體外人工肝人工腎裝置、組織工程口腔黏膜，骨修復材料，預防齲齒、牙齒鬆動、牙齦出血、牙齒修復，創傷修復等方面的廣泛套用。
權利要求
《一種具有誘導基因表達的骨生物修複製劑的製備方法》其特徵在於所述方法包括如下步驟：
（1）製備氧化鈣：取石灰石在鉑金罐中密封，在1900℃的條件下高溫煅燒，冷卻後經粉碎成為10-20納米的CaO粉末；
（2）生成羥基磷灰石：取規格為10-20納米的CaO和P2O5納米粉末，質量比1:1.67混合均勻（500克），在36-38℃的情況下，無光條件下陳化至少12小時；加入醫用純淨水500克攪拌成糊狀，隨後加入Na2O2（3克）38℃下攪拌45分鐘，過10-20目篩，得到粒徑為10-20納米的羥基磷灰石；
（3）向步驟（2）所得羥基磷灰石中加入SiO2（5克）混合均勻後，在-15～-20℃下冷凍乾燥成粉末，並加入醫用甘油10克、醫用聚乙二醇10克、醫用級鈦白粉3克、香精1克、卡波姆2-3克、AK糖3克和十二烷基硫酸鈉2克，均勻混合；
（4）滅菌：將步驟（3）混合所得膏狀體在10℃條件下，輻照滅菌2小時；
（5）乾燥：將步驟（4）所得的生物製劑，在-15℃條件下凍乾成固體狀；
（6）粉碎：將該固體粉碎成為20納米的粉末狀；
（7）包裝：將滅菌膏體灌裝在無菌低密度聚乙烯管內，每管質量為60克。
實施方式
《一種具有誘導基因表達的骨生物修複製劑的製備方法》的製劑的製備方法包括如下步驟：
（1）製備氧化鈣：取石灰石在鉑金罐中密封，在1900℃的條件下高溫煅燒，冷卻後經粉碎成為10-20納米的CaO粉末；
（2）生成具有生物活性的羥基磷灰石：取規格為10-20納米的CaO和P2O5納米粉末，按照質量比1:1.67混合均勻為500克的粉末，在36-38℃的情況下，無光條件下陳化至少12小時；加入醫用純淨水500克攪拌成糊狀，隨後加入Na2O2（3克）38℃下攪拌45分鐘，過10-20目篩，得到粒徑為10-20納米的羥基磷灰石Ca10（PO4）6（OH）2（HA）；
（3）向步驟（2）所得羥基磷灰石中加入SiO2（5克）混合均勻後，在-15～-20℃下凍乾機冷凍乾燥成粉末，並加入醫用甘油10克、醫用聚乙二醇10克、醫用級鈦白粉3克、香精1克、卡波姆2-3克、AK糖3克和十二烷基硫酸鈉2克，均勻混合；
（4）滅菌：將步驟（3）混合所得膏狀體在10℃條件下，輻照滅菌2小時；
（5）乾燥：將步驟（4）所得生物製劑，在-15℃條件下凍乾成固體狀；
（6）粉碎：將該固體粉碎成為20納米的粉末狀。
（7）包裝：將滅菌膏體灌裝在無菌低密度聚乙烯管內，每管質量為60克。
技術效果
臨床試驗研究報告：含該發明的骨修復生物製劑的牙膏與標準含氟牙膏對減輕牙齦炎症及菌斑效果的臨床研究報告。
研究人群和方法
該研究為隨機、雙盲、對照、平行的臨床研究。試驗牙膏為該發明實施方式的骨修複製劑製成的牙膏，陰性對照標準含氟牙膏。所有牙膏統一包裝。所有受試用者使用同一廠家生產的同一型號牙刷。
受試者參加口腔軟組織及硬組織檢查，齦炎及菌斑檢查，按照納入和排除標準決定實驗對象是否入選。
納入標準：
（1）全身健康狀況良好；
（2）年齡在18～70周歲；
（3）如果為女性，不得處於妊娠期和哺乳期內；
（4）改良Quigley-Hein菌斑指數≥1.5；
（5）Loe-Silness齦炎指數≥1.0；
（6）沒有同時參加其他類似試驗研究。
排除標準：
（1）至少20顆牙無活性齲、冠和V類型修復體；
（2）口腔有明顯未治療齲（肉眼觀）；
（3）無進展性牙周炎，如超過4毫米的牙周袋不超過2個位置；
（4）懷孕或哺乳期；
（6）長期食用抗生素治療；
（7）戴正畸帶環，部分或全口活動義齒，橋修復體超過4顆天然牙；
（8）有嚴重的牙齦炎和牙周病；
（9）有嚴重的牙科病變：齲。牙周病、癌前病變、口腔炎性狀態；
（10）正在參加其他研究；
（11）對牙膏的成分發生過敏。
共100位研究對象參加了該發明產品的臨床研究，將其隨機分為試驗組與對照組。給受試者統一發放各自相應的牙膏和軟質牙刷，要求受試者按規定1日刷牙2次（早、晚），每次時間1分鐘。要求試驗過程中不使用任何其他口腔衛生用品，如其他種類的牙膏、牙刷、漱口液、牙線等。對飲食和抽菸不作限制。6周時補充試驗的牙膏和牙刷。在使用藥膏牙刷6周和12周時，對受試者牙菌斑和牙齦炎狀況按照基線檢查的程式進行再評估。
在基線、6周和12周評價前8小時不進行口腔清潔。採用改良的Q-H菌斑指數和牙齦指數（Silness&PlaqueIndex）評價牙周狀況。
齦炎指數及檢查方法：牙齦炎採用改良Loe-Silness齦炎指數測量，在測量菌斑指數之前測量牙齦情況。牙齦炎計數方法及標準如下：0=無齦炎；1=輕度齦炎，牙齦色澤和質地略有變化，但探診無出血；2=中度炎症，牙齦光亮。紅、腫，增生、探診出血；3＝重度炎症，牙齦明顯發紅、增生、有自發性出血。
檢查每個牙頰面及舌面，除第三磨牙、假牙和有頸部修復體的牙，其餘的牙均包括在計數之列。Loe-Silness齦炎指數的均數是指所有牙計數值的總和除以總的測量面數所得數值。
菌斑指數及檢查方法：採用Quigley-Hein改良Turesky菌斑指數評價齦上菌斑。牙菌斑染色，首先滴5滴染色劑，用舌頭將染色劑布滿整個牙面（30秒），含一小口水，在囑咐受試者含漱30秒，使染色劑充分與牙面接觸，清水漱口。使用菌斑染色劑染色後根據下列標準記錄：0=無菌斑；1=牙頸部邊緣存在散在的菌斑；2＝牙頸邊緣可見連續的薄菌斑帶（達1毫米寬）；3＝牙頸部菌斑帶大於1毫米但少於牙面的1/3；4=菌斑覆蓋牙面的1/3-2/3；5=菌斑覆蓋牙面2/3以上。
檢查每個牙齒的頰面和舌面。出第三磨牙、假牙和有頸部修復體的牙，其餘的牙均在記數之列。每一受試者菌斑指數的均數由個人全部牙齒檢查所得計數之和除以總的測量數得到。
統計方法：數據採用SPSS16.0統計軟體的ANOVA及t檢驗進行統計分析，採用雙側檢驗，檢驗水準a為0.05。
結果：100位受試者參加該研究，6周檢查時隨訪98例，12周隨訪96例，失訪率為4.0％。試驗對象及檢查者均沒有牙膏副作用的報告，失訪的主要原因是外出、生病，使用抗生素等，失訪受試者退出該研究的原因與使用研究牙膏無關。試驗結果如下：
分組 | 人數 | 年齡 | 性別 | |
男 | 女 | |||
試驗組 | 48 | 24.1（3.6） | 10 | 38 |
對照組 | 48 | 24.9（2.8） | 15 | 33 |
*均數±標準差，臨床檢查結果見表2。
6周檢查結果：使用該發明的試驗牙膏與對照組比較，6周減少齦上菌斑（PI）和齦炎指數（GI）組間均顯示統計學意義的差異（p<0.05）。
12周檢查結果：使用該發明的試驗牙膏與對照組比較，12周減少齦上菌斑（PI）和齦炎指數（GI）組間均顯示統計學意義的差異（p<0.05）。
臨床未見副作用報告。
/ | 菌斑指數：均數（標準差） | ||
/ | 試驗組 | 對照組 | P |
/ | n=48 | n=48 | / |
基線（*） | 2.66（0.35） | 2.75（0.54） | p=0.927 |
6周（*） | 2.41（0.40） | 2.67（0.56） | p=0.036 |
12周（*） | 2.31（0.40） | 2.70（0.59） | p=0.001 |
均數差 基線-6周 | 0.36（0.39） P<0.001 | 0.13（0.41） p=0.083 | p=0.026 |
均數差 基線-12周 | 0.48（0.44） P<0.001 | 0.08（0.49） p=0.244 | p=0.001 |
/ | 牙齦出血指數：均數（標準差） | ||
/ | 試驗組 | 對照組 | P |
/ | n=48 | n=48 | / |
基線（*） | 1.66（0.34） | 1.58（0.23） | p=0.773 |
6周（*） | 1.35（0.22） | 1.47（0.20） | p=0.017 |
12周（*） | 1.22（0.23） | 1.37（0.17） | p=0.002 |
均數差 基線-6周 | 0.23（0.22） P<0.001 | 0.13（0.17） P<0.001 | p=0.026 |
均數差 基線-12周 | 0.35（0.23） P<0.001 | 0.21（0.14） p=0.001 | p=0.002 |
結論：以上臨床研究表明，使用含該發明的骨修複製劑的牙膏與使用對照牙膏相比，具有抑制牙菌斑的形成，減輕牙齦炎，改善牙齦健康的作用。在臨床試驗期間未觀察到牙膏的副作用。
榮譽表彰
2018年12月20日，《一種具有誘導基因表達的骨生物修複製劑的製備方法》獲得第二十屆中國專利銀獎。
