一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒

《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》是成都先導藥物開發有限公司於2012年12月20日申請的專利，該專利的申請號為2012105555483，公布號為CN103882532A，授權公布日為2014年6月25日，發明人是李進、江洋、陳湜、瞿慶喜、萬金橋、鐘麗娜、葛嘯虎、黃奇。

《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》包括如下步驟：（1）取原料：取i種合成砌塊與（i+2）種單鏈DNA片段；（2）用組合化學方法合成化合物，得到單鏈DNA標記的化合物的文庫；（3）篩選：對DNA標記的化合物的文庫進行篩選；（4）測序：取步驟（3）篩選得到的DNA標記的化合物，對DNA標記的化合物上的DNA測序，根據DNA序列即可確定該化合物的合成砌塊和反應歷程。該發明還公開了一種先導化合物的合成及篩選試劑盒，以及一種組合化學文庫。該發明方法及試劑盒可以快速有效地合成並篩選得到目的先導化合物，操作簡便，成本低廉。

2016年12月7日，《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》獲得第十八屆中國專利優秀獎。

（概述圖為《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》摘要附圖）

基本介紹

• 中文名：一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒
• 公布號：CN103882532A
• 授權日：2014年6月25日
• 申請號：2012105555483
• 申請日：2012年12月20日
• 申請人：成都先導藥物開發有限公司
• 地址：四川省成都市高新區馮家港工業園科園南路88號3號研發樓1001號
• 發明人：李進、江洋、陳湜、瞿慶喜、萬金橋、鐘麗娜、葛嘯虎、黃奇
• Int.Cl.：C40B40/04(2006.01)I、C40B50/04(2006.01)I、C40B20/04(2006.01)I、C40B70/00(2006.01)I
• 代理機構：成都高遠智慧財產權代理事務所（普通合夥）
• 代理人：李高峽、張娟
• 類別：發明專利

專利背景

自20世紀80年代末期，隨著分子生物學研究的突破—高通量篩選技術的發展，新藥開發所需要的新分子實體的數目越來越多，科學家們把注意力從尋找天然產物轉入合成大數目的化合物群—化學庫，化學庫是由諸多不同屬性的有機化合物組成的。組合化學方法是一種合成化學庫的技術，運用這項技術，不同系列的合成砌塊—反應成分有序地排列起來以組成大系列的多樣化分子實體群。組合化學合成法經常被人們稱為數字遊戲，也就是如何排列眾多的合成砌塊的問題，從理論上講，組合合成的總反應產物數N是由兩個因素決定的，每一步的合成砌塊數目b和合成的步驟x，例如，對於一個三步的線性組合反應，如果每步的反應物數目分別是b1、b2、b3，那么理論上的總反應產物的數目是N=b1b2b3。組合化學研究的目標就是怎樣有效地得到這一反應的所有產物N。近年來，從固相合成到快速液相平行合成，組合化學在合成方法上取得了突破性的進展，常用的幾種合成方法有固相有機合成和液相有機合成，固相有機合成包括混合裂分法和平行合成法，液相有機合成包括多組分液相合成法和官能團轉化法。

組合化學合成技術建立的化學庫中，產物成千上萬，甚至上億，像經典有機合成那樣一個一個的純化分離鑑定已不再可能。高通量篩選（High through put screening，HTS）技術是指以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化作業系統執行試驗過程，以靈敏快速的檢測儀器採集實驗結果數據，以計算機對實驗數據進行分析處理，同一時間對數以千、萬計的樣品檢測，並以相應的資料庫支持整個體系運轉的技術體系。高通量篩選方法極大地提高了小分子化合物篩選的速度和效率，可以從組合化學文庫中篩選作用於靶標分子的化合物。但是，用傳統的高通量篩選方法將化合物從化學文庫中篩選出來後，純化並確定目標化合物的結構非常困難，需要的時間長，成本高，隨著化合物文庫的擴大，難度更大。

為了解決該問題，申請號：95193518.6，發明名稱：“用標記編碼的複雜組合化學文庫”的專利申請公開了一種方法，即在合成的每個階段，在化合物進行合成的載體（例如顆粒）上，專一地進行標記，以定義隨同該載體上化合物合成時伴隨的特定事項（通常指所加化學試劑）。所述標記使用鑑定劑分子來完成，該分子記錄合成期間載體顆粒所經歷的按順序的事項，由此提供在該載體上生產化合物的反應歷程。但是該申請並未提供實現該方法的技術方案。

2012年12月前技術中有報導使用寡核苷酸標記化合物的合成單元，根據生物領域的常識，在常規條件下，雙鏈DNA較單鏈DNA穩定，因此通常選擇雙鏈的寡核苷酸對化合物的合成單元進行標記，如：

公告號：EP0643778，發明名稱：“Encoded combinatorial chemical libraries”的專利公開了用單鏈寡核苷酸標記胺基酸或多肽的方法；公告號：US7935658，發明名稱：“Methods for synthesis of encoded libraries”的專利公開了一種用雙鏈DNA片段標記合成砌塊，形成化合物文庫的方法；申請號：WO/2010/094036，發明名稱：“Methods of creating and screening dna-encoded libraries”的專利申請公開了用寡核苷酸標記化合物，形成化合物文庫的方法，其寡核苷酸為發卡結構的雙鏈DNA。

但是，用雙鏈DNA標記合成砌塊或者化合物時，在連線延伸過程中，雙鏈DNA容易交聯，形成捲曲的三級結構，測序時，需要解鏈，操作較複雜，用雙鏈DNA標記三步以上的線性組合反應時，雙鏈DNA的測序結果誤差較大，導致該方法只能停留在兩維，因而只能通過增加每一步反應的合成砌塊數目來增加文庫中化合物數量，製得的化合物文庫多樣性差，不易合成得到目標化合物。

需要尋找新的，操作簡便，結果更準確的標記方法。

發明內容

專利目的

《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》提供了一種先導化合物的合成及篩選的試劑盒和方法，以及一種新的組合化學文庫。

名詞解釋

合成砌塊（Synthetic Building Block），又叫合成子，是指具備各種理化性質以及特定生物化學性質的、在新藥（西藥、農藥）研發過程中必須使用的小分子化合物。

先導化合物（lead compound）簡稱先導物，是通過各種途徑和手段得到的具有某種生物活性和化學結構的化合物，用於進一步的結構改造和修飾，是現代新藥研究的出發點。

反應歷程：就是反應所經歷的過程。

串聯連線：是指若干段單鏈DNA序列之間依次兩端點相連，且連線點上沒有分枝。

技術方案

《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》的方法包括如下步驟：

（1）取原料：i種合成砌塊與（i+2）種單鏈DNA片段，（i+2）種單鏈DNA片段包括i種標記序列、1種始端序列和1種末端序列，i種標記序列分別特異標記i種合成砌塊，其中，i=1，2，3…n；

（2）用組合化學方法合成化合物：

a、製備初始合成砌塊：選擇1~i種合成砌塊，將始端序列的一端連線在合成砌塊上，另一端與所述合成砌塊的特異標記序列串聯連線，得到1~i種標記有一端游離的單鏈DNA的初始合成砌塊；

b、以步驟a得到的初始合成砌塊為基礎，用線性組合反應的方式合成化合物，合成過程中，每加入新的合成砌塊，就在與初始合成砌塊相連的單鏈DNA游離端串聯連線所加入合成砌塊的特異標記序列，使所述單鏈DNA逐漸延長，合成結束後，在所述單鏈DNA游離端串聯連線末端序列，即得到單鏈DNA標記的化合物文庫；

（3）篩選：對DNA標記的化合物的文庫進行篩選，選出目標化合物；

（4）測序：將步驟（3）篩選得到的目標化合物的DNA進行測序，確定目標化合物的結構。

其中，步驟（1）所述始端序列包括多聚腺苷。優選地，所述多聚腺苷為12~20個腺苷。

其中，步驟（1）所述標記序列的長度不低於6bp。優選地，所述標記序列的長度為9個bp。

其中，所述步驟（2）合成過程中，pH為8~12，溫度為0~30℃。

其中，步驟（1）所述標記序列的3’端連線一個核糖核苷酸。所述核糖核苷酸為胞苷。

其中，步驟（2）中，a步驟中始端序列與初始合成砌塊連線的方法是：

將始端序列氨基化，初始合成砌塊羧基、巰基或炔基化，反應即得。

其中，步驟（2）所述連線始端序列與標記序列、標記序列之間或者標記序列與末端序列的連線方法是：用多核苷激酶使得單鏈DNA的5’-端磷酸化，用RNA連線酶連線，即可。所述的多核苷激酶為T4多核苷激酶，所述RNA連線酶為T4RNA連線酶。

其中，所述步驟（3）中的篩選方法是基於受體-配體特異性反應的篩選方法。

《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》先導化合物的合成及篩選試劑盒，它包括如下成分：

1）i種合成砌塊與（i+2）種單鏈DNA片段，單鏈DNA片段分為始端序列、末端序列和i種標記序列，i種標記序列分別特異標記i種合成砌塊，其中，i=1，2，3…n；

2）始端序列與合成砌塊連線用試劑、組合化學方法用試劑和單鏈DNA片段連線用試劑；

3）化合物篩選用試劑；

4）DNA測序用試劑。

其中，成分1）所述始端序列包括多聚腺苷。優選地，所述多聚腺苷為12~20個腺苷。

其中，成分1）所述標記序列的長度不低於6bp。優選地，所述標記序列的長度為9個bp。

其中，步驟（1）所述標記序列的3’端連線一個核糖核苷酸。所述核糖核苷酸為胞苷。

其中，成分2）所述始端序列與合成砌塊連線用試劑包含氨基化單鏈DNA的試劑以及羧基、巰基或炔基化初始合成砌塊的試劑。

其中，成分2）所述單鏈DNA片段連線用試劑包括多核苷激酶和RNA連線酶。

優選地，所述的多核苷激酶為T4多核苷激酶，所述RNA連線酶為T4RNA連線酶連線。

《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》組合化學文庫，它是以合成砌塊為原料，用組合化學方法合成的組合化學文庫，其中，每個化合物標記了一段單鏈DNA序列，該單鏈DNA序列的結構為始端序列—i種標記序列—末端序列，所述i種標記序列特異標記i種組合化學合成過程中使用的合成砌塊，其排列順序與組合化學合成過程中合成砌塊的加入順序相同。

其中，所述標記序列的長度不低於6bp。優選地，所述標記序列的長度為9個bp。

標記序列的長度為6時，可製備4096個不同序列的單鏈DNA片段，DNA片段編碼的、用於製備組合化學文庫的合成砌塊數以千計，能滿足大多數化合物合成及篩選的需要；標記序列為或9時，可製備262144個不同序列的單鏈DNA片段，其編碼的、用於製備組合化學文庫的合成砌塊高達262144個，DNA片段編碼的、用於製備組合化學文庫的合成砌塊數以百萬計，完全可以滿足化合物合成及篩選的需要。若標記序列越長，其可以編碼的合成砌塊數量越大，製備的組合化學文庫越大，但是相應的，成本越高，綜合考慮庫容和成本，標記序列的長度為9時最優。

改善效果

在《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》條件下，用單鏈DNA標記合成砌塊，連線過程中，單鏈DNA之間不會互補而形成雙鏈，結構穩定，也不易交聯，測序時不需要解鏈，操作簡單、快速、結果準確。因此，該發明方法可以包含多步線性組合反應，合成的化合物文庫多樣性好，庫容大，容易合成得到目標化合物並確定其合成砌塊、反應歷程及化學結構，從而迅速合成得到大量目標化合物，是一種準確高效、操作簡便、成本低廉的先導化合物文庫合成和篩選方法，套用前景良好。

附圖說明

圖1《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》用組合化學方法合成化合物的進程示意圖，其中，“H”表示合成砌塊；“初”表示初始序列；“B”表示標記序列，其特異標記合成砌塊，數字代表二者的對應關係，如，B1特異標記H1；“末”表示末端序列；左欄表示反應步驟，與實施例1反應步驟一致；得到的終產物，合成砌塊從右至左僅表示合成砌塊的加入順序，初始序列、標記序列和末端序列從左至右表示最終得到的單鏈DNA序列的結構；

圖2該發明化學文庫以及篩選得到的胰蛋白酶抑制劑的電泳圖；

圖3測序結果柱狀圖，柱與化合物一一對應，其高度與該化合物與靶標的結合力相關；

圖4該發明胰蛋白酶抑制劑的IC50圖譜；

圖5該發明胰蛋白酶抑制劑的IC50圖譜。

技術領域

《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》涉及化學領域，特別是涉及一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒。

權利要求

1.一種先導化合物的合成及篩選方法，其特徵在於：包括如下步驟：

（1）取原料：i種合成砌塊與（i+2）種單鏈DNA片段，（i+2）種單鏈DNA片段包括i種標記序列、一種始端序列和一種末端序列，i種標記序列分別特異標記i種合成砌塊，其中，i＝1，2，3…n；

（2）用組合化學方法合成化合物文庫：

a、製備初始合成砌塊：選擇1～i種合成砌塊，將始端序列的一端連線在合成砌塊上，另一端與所述合成砌塊的特異標記序列串聯連線，得到1～i種標記有一端游離的單鏈DNA的初始合成砌塊；

b、用步驟a得到的初始合成砌塊，與1～i種合成砌塊，用線性組合反應的方式合成化合物，合成過程中，每加入新的合成砌塊，就在與初始合成砌塊相連的單鏈DNA游離端串聯連線所加入合成砌塊的特異標記序列，使所述單鏈DNA逐漸延長，合成結束後，在所述單鏈DNA游離端串聯連線末端序列，即得到單鏈DNA標記的化合物文庫；

（3）篩選：對DNA標記的化合物的文庫進行篩選，選出目標化合物；

（4）測序：將步驟（3）篩選得到的目標化合物的DNA進行測序，確定目標化合物的合成砌塊和反應歷程；

步驟（1）所述標記序列的3’端連線一個核糖核苷酸；所述核糖核苷酸為胞苷；步驟（1）所述始端序列包括多聚腺苷。

2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述多聚腺苷為12～20個腺苷。

3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（1）所述標記序列的長度不低於6bp。

4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於：所述標記序列的長度為9bp。

5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（2）中，a步驟中始端序列與初始合成砌塊連線的方法是：將始端序列氨基化，初始合成砌塊羧基、巰基或炔基化，反應即得。

6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（2）中，合成過程pH為8～12，溫度為0～30℃。

7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（2）中，始端序列與標記序列、標記序列之間或者標記序列與末端序列的連線方法是：用多核苷激酶使得單鏈DNA的5’-端磷酸化，用RNA連線酶連線，即可。

8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於：所述的多核苷激酶為T4多核苷激酶，所述RNA連線酶為T4RNA連線酶。

9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（3）所述篩選方法是基於受體-配體特異性反應的篩選方法。

10.一種先導化合物的合成及篩選試劑盒，其特徵在於：它包括如下成分：

1）i種合成砌塊與（i+2）種單鏈DNA片段，（i+2）種單鏈DNA片段包括i種標記序列、一種始端序列和一種末端序列，i種標記序列分別特異標記i種合成砌塊，其中，i＝1，2，3…n；

2）始端序列與初始合成砌塊連線用試劑、組合化學方法合成用試劑和單鏈DNA片段連線用試劑；

3）化合物篩選用試劑；4）DNA測序用試劑；

成分1）所述標記序列的3’端連線一個核糖核苷酸；所述核糖核苷酸為胞苷；成分1）所述始端序列包括多聚腺苷。

11.根據權利要求10所述的試劑盒，其特徵在於：所述多聚腺苷為12～20個腺苷。

12.根據權利要求10所述的試劑盒，其特徵在於：成分1）所述標記序列的長度不低於6bp。

13.根據權利要求12所述的試劑盒，其特徵在於：所述標記序列的長度為9bp。

14.根據權利要求10所述的試劑盒，其特徵在於：成分2）所述始端序列與合成砌塊連線用試劑包含氨基化單鏈DNA的試劑以及羧基、巰基或炔基化合成砌塊的試劑。

15.根據權利要求10所述的試劑盒，其特徵在於：成分2）所述單鏈DNA片段連線用試劑包括多核苷激酶和RNA連線酶。

16.根據權利要求15所述的試劑盒，其特徵在於：所述的多核苷激酶為T4多核苷激酶，所述RNA連線酶為T4RNA連線酶連線。

17.一種組合化學文庫，其特徵在於：它是以合成砌塊為原料，用權利要求1～9任意一項所述的組合化學方法合成的組合化學文庫，其中，每個化合物標記了一段單鏈DNA序列，該單鏈DNA序列的結構為始端序列—i種標記序列—末端序列，所述i種標記序列特異標記i種組合化學合成過程中使用的合成砌塊，其排列順序與組合化學合成過程中合成砌塊的加入順序相同。

18.根據權利要求17所述的組合化學文庫，其特徵在於：所述標記序列的長度不低於6bp。

19.根據權利要求18所述的組合化學文庫，其特徵在於：所述標記序列的長度為9個bp。

實施方式

實施例1 該發明先導化合物的合成及篩選方法

1、製備方法

（1）取合成砌塊和單鏈DNA片段：

i種合成砌塊與（i+2）種單鏈DNA片段，（i+2）種單鏈DNA片段包括i種標記序列、一種始端序列和一種末端序列，i種標記序列分別特異標記i種合成砌塊，其中，i=1，2，3…n；始端序列上可連線多聚腺苷，以便分離純化，標記序列上均可以連線胞苷，提高后續單鏈DNA片段的連線效率。

（2）合成：如圖1所示，用組合化學方法合成化合物文庫：

a、製備初始合成砌塊：選擇1~i種合成砌塊，將始端序列的一端連線在合成砌塊上，另一端與所述合成砌塊的特異標記序列串聯連線，得到1~i種標記有一端游離的單鏈DNA的初始合成砌塊，如，i=2；①初始合成砌塊與始端序列連線：取始端序列，氨基化，取合成砌塊1和2，羧基、巰基或炔基化；取活化的合成砌塊1和2與活化的始端序列反應，得連線了始端序列的初始合成砌塊；②分別在始端序列上連線合成砌塊1和2的標記序列（該連線方法除了可以用下述方法以外，還可以用其他單鏈DNA的連線方法）：用多核苷激酶使得單鏈DNA的5’-端磷酸化；RNA連線酶連線，即可；③混合，得初始合成砌塊混合物。

b、以步驟a得到的初始合成砌塊為基礎，用線性組合反應的方式合成化合物，合成過程中，每加入新的合成砌塊，就在與初始合成砌塊相連的單鏈DNA游離端串聯連線所加入合成砌塊的特異標記序列，使所述單鏈DNA逐漸延長，合成結束後，在所述單鏈DNA游離端串聯連線末端序列，即得到單鏈DNA標記的化合物文庫；比如，三步線性組合反應。

I：①合成（除了下述合成方法以外，還可以用其他化學合成方法）：取合成砌塊3~4，置於2個微型反應容器中，分別與步驟a製得的初始合成砌塊混合物中混合，按照混合裂分法、平行合成法、多組分液相合成法或者官能團轉化法合成；②加標記序列：同步驟a步驟②。③混合，得混合物。

Ⅱ：①合成（除了下述合成方法以外，還可以用其他化學合成方法）：取合成砌塊5~6，置於2個微型反應容器中，分別與步驟b製得混合物混合，按照混合裂分法、平行合成法、多組分液相合成法或者官能團轉化法合成；②加標記序列：同步驟a步驟②。③加末端序列：同步驟a步驟②。④混合，即得到單鏈DNA標記的化合物的文庫。

（3）篩選：對DNA標記的化合物的文庫進行篩選：

基於受體-配體特異性反應的色譜分離篩選方法，用生物靶分子對DNA標記的化合物的文庫進行篩選。

對色譜進行洗脫，將未與生物靶標分子結合的DNA標記的化合物除去，分離得到與生物靶分子結合的DNA標記的化合物。

（4）測序：

取步驟（3）篩選得到的DNA標記的化合物，對DNA標記的化合物上的DNA測序，根據DNA序列即可確定該化合物的合成砌塊和反應歷程。

實施例2 用該發明方法成和篩選胰蛋白酶配體

1、材料和試劑

T4 PNK（500U NEB-M0201V），T4RNA ligase 1（NEB-M0204S），Cartridges（PCR purification Kit（cat.no 28104，Nucleotides removal Kit cat.no 28306）purchased from Qiagen（Hilden，Germany）.dNTPs（0.5毫摩爾/升，NEB，cat.no89009）.

表1所示單鏈DNA片段，由Genscript公司和Biosune公司合成。

2、製備方法

（1）製備單鏈DNA片段：

該實施例一共用了多少個合成砌塊，請提供這寫合成砌塊及其編碼序列。

54種合成砌塊與56種單鏈DNA片段，57種單鏈DNA片段包括55種標記序列、1種始端序列和1種末端序列；

下述標記序列上均可以連線胞苷，提高后續單鏈DNA片段的連線效率。

（2）合成：

a、製備初始合成砌塊：選擇一種合成砌塊，將始端序列的一端連線在合成砌塊上，另一端與所述合成砌塊的特異標記序列串聯連線，得到一種標記有一端游離的單鏈DNA的初始合成砌塊；①初始合成砌塊與始端序列連線：取始端序列，氨基化，取合成砌塊1，羧基化；取活化的合成砌塊1與活化的始端序列反應，得連線了始端序列的初始合成砌塊。反應混合物總體積為150微升，溶劑為水和二甲亞碸體積比為3:7，其中含三乙胺鹽酸緩衝體系（pH10.0，80毫摩爾/升），其中，合成砌塊1的濃度為30毫摩爾/升，活化試劑1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）濃度為4毫摩爾/升，2-磺酸基-N-羥基琥珀醯亞胺濃度為10毫摩爾/升，始端序列濃度為20摩爾/升，室溫反應1小時。②在始端序列上連線合成砌塊1的標記序列（該連線方法除了可以用下述方法以外，還可以用其他單鏈DNA的連線方法）：用多核苷激酶使得單鏈DNA的5’-端磷酸化；RNA連線酶連線，即可。連線：取步驟①處理後的始端序列與標記序列1，15微升的反應混合物包括225皮摩爾始端序列、25皮摩爾標記序列1、50單位T4RNA連線酶以及連線反應的緩衝液；該混合物在25℃孵育1.5h，後再70℃加熱20分鐘，T4RNA連線酶變性；加入T4多核苷酸激酶和1nmATP，反應10個循環，接著在75℃孵育20分鐘使額外的多核苷激酶變性；純化：產物用等體積的2×上樣緩衝液中，該緩衝液包含40毫摩爾/升Tris-HCL（pH7.6）、1摩爾/升NaCL和1毫摩爾/升EDTA；得到的混合物通過如下步驟純化：反應液上QiagenCartridge柱子；用1×上樣緩衝液懸浮；1000轉每分離心1分鐘，用矽化玻璃棉過濾；用1×上樣緩衝液、0.5摩爾/升NaCL溶液和80%乙醇依次沖洗；用20微升PE洗脫液洗脫；真空乾燥，即可。

b、以步驟a得到的初始合成砌塊為基礎，用三步線性組合反應的方式合成化合物，合成過程中，每加入新的合成砌塊，就在與初始合成砌塊相連的單鏈DNA游離端串聯連線所加入合成砌塊的特異標記序列，使所述單鏈DNA逐漸延長，合成結束後，在所述單鏈DNA游離端串聯連線末端序列，即得到單鏈DNA標記的化合物文庫；

第一批合成砌塊，即初始砌塊（1個）：合成砌塊1；

第二批合成砌塊（5個）：合成砌塊2~6；

第三批合成砌塊（49個）：合成砌塊7~55；

I：①合成：取合成砌塊2~6，分別置於5個微型反應容器中，與步驟a製得的初始合成砌塊混合，按照混合裂分法、平行合成法、多組分液相合成法或者官能團轉化法合成。分別置於5個微型反應容器中，與步驟a製得的初始合成砌塊反應。以合成砌塊2為例，反應條件為150微升反應混合物，溶劑為水和二甲亞碸體積比為3:7，其中含三乙胺鹽酸緩衝體系（pH9.0，80毫摩爾/升），合成砌塊1的濃度為30毫摩爾/升，活化試劑1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）4毫摩爾/升，2-磺酸基-N-羥基琥珀醯亞胺10毫摩爾/升，合成砌塊2的濃度1.5摩爾/升，室溫反應15小時。②分別加合成砌塊2~6的標記序列：同步驟a步驟②。③混合，得混合物。

Ⅱ：①合成：取合成砌塊7~55，分別置於49個微型反應容器中，與步驟a製得的初始合成砌塊混合，按照混合裂分法、平行合成法、多組分液相合成法或者官能團轉化法合成。分別置於49個微型反應容器中，與步驟a製得的初始合成砌塊反應。以合成砌塊2為例，反應條件為150微升反應混合物，溶劑為水和二甲亞碸體積比為3:7，其中含三乙胺鹽酸緩衝體系（pH9.0，80毫摩爾/升），合成砌塊1的濃度為30毫摩爾/升，活化試劑1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）4毫摩爾/升，2-磺酸基-N-羥基琥珀醯亞胺10毫摩爾/升，合成砌塊2的濃度1.5摩爾/升，室溫反應15小時。②加標記序列：同步驟a步驟②。③加末端序列：同步驟a步驟②。④混合，即得到單鏈DNA標記的化合物的文庫。

（3）篩選：對DNA標記的化合物的文庫進行篩選：

基於受體-配體特異性反應的色譜分離篩選方法，用生物靶分子對DNA標記的化合物的文庫進行篩選。

①CNBr樹脂活化：1）0.1033克CBNr活化Sepharose4B樹脂，並把它們分為2支，然後在4毫升的1毫摩爾/升的氯化氫溶液（PH3.0）里靜止；2）用1毫摩爾/升的鹽酸（pH值3.0）清洗液清洗15分鐘；3）將4毫克的胰蛋白酶溶解在0.5毫升的偶聯緩衝液（0.1摩爾/升碳酸氫鈉，0.5摩爾/升氯化鈉，pH值8.3）中；4）輕微上下震盪混合物1小時，在室溫或4℃過夜孵育；5）用4摩爾/升L耦合溶液洗去多餘的蛋白質；6）將樹脂轉入4毫升0.1摩爾/升的Tris-HCl緩衝液（pH8.0）中，孵育2小時；7）用清洗緩衝液1和2清洗樹脂三次；（清洗液1:0.1摩爾/升aceticacid，0.5摩爾/升NaCl，pH4.0;，清洗液2:0.1摩爾/升Tris-HCl，0.5摩爾/升NaCl，pH8.0.）8）離心分離樹脂，6000轉/分鐘，10分鐘。

②胰蛋白酶在活化CNBr樹脂上的固化：1）稱取100毫克活化的CNBr樹脂至於4毫升1毫摩爾/升的鹽酸中孵育；2）用8毫升的1毫摩爾/升鹽酸（PH值3.0）清洗；3）將0.004毫克/毫升，0.02毫克/毫升，0.1毫克/毫升，0.5毫克/毫升，2.5毫克/毫升的胰蛋白酶溶液分別與五份活化CNBr樹脂混合，在4℃下孵育5小時；4）用0.1摩爾/升Tris鹽酸，0.5摩爾/升氯化鈉，（pH值8.3）溶液清洗樹脂；5）用0.1摩爾/升醋酸鈉，0.5摩爾/升氯化鈉，（pH4.0）溶液清洗樹脂；6）重複4，5步驟，交替清洗至少3個循環。7）將胰蛋白酶固化的樹脂在4℃下保存在PBS緩衝液中（pH7.4）；

③胰蛋白酶化合物庫親和篩選：1）取的步驟（2）得到的單鏈DNA標記的化合物的文庫與PBS緩衝液以1:15體積比混合（17微升:255微升）；2）分別將50微升的文庫樣品加入胰腺牛胰蛋白酶/CNBr樹脂漿（2.5，0.5，0.1，0.02，0.004和0毫克/毫升）；3）用PBS緩衝液配製0.3毫克/毫升的鯡魚精DNA溶液；4）步驟3）得到的鯡魚精DNA溶液與步驟2）得到的胰腺牛胰蛋白酶/CNBr樹脂漿在25℃下孵育1小時；5）將步驟4）的混合物轉移到2毫升的Spin柱子中，除去上清液；6）用200微升PBS緩衝液洗滌樹脂，重複4次；7）在清洗後的漿液中加入100微升無菌水，篩選得到與胰蛋白酶配體樣品。

鑑定：取步驟（2）得到的單鏈DNA標記的化合物文庫與步驟（3）篩選得到的胰蛋白酶親和樣品電泳檢測。

檢測結果如圖2所示，用胰腺牛胰蛋白酶/CNBr樹脂漿篩選均得到一目標條帶，陰性對照則為空白條帶，說明《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》篩選得到了純化的胰蛋白酶配體樣品。

（4）測序：取步驟（3）篩選得到的DNA標記的化合物，對DNA標記的化合物上的DNA測序，根據DNA序列即可確定該化合物的合成砌塊和反應歷程：取步驟（3）篩選得到的樣品進行聚合酶連結反應（PCR），將編碼化合物的寡核苷酸代碼進行PCR擴增（總體積50微升，30個循環，每個循環94℃1分鐘，55℃反應1分鐘，72℃反應40秒），以5微升胰蛋白酶245庫（濃度100摩爾/升）為模板。

採用Illumina Hiseq2000高通量測序平台，測序流程如下：

1）PCR擴增後的篩選寡核苷酸文庫，利用Axygen公司的MAG-PCR-CL-250試劑盒進行純化及質量檢測報告；

2）利用Illu分鐘a公司的Picogreen試劑盒進行核酸定量，得出樣品核酸濃度，進行下一步測序文庫製備；

3）利用Illu分鐘a公司的chip-seq DNA sample試劑盒將Hiseq2000特定測序接頭（6個鹼基長度）接在測序樣本的5‘端和3’端，再固定到Hiseq2000測序儀的晶片chip-seqplate上面，進行下一步橋式擴增；

4）利用Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑盒進行核酸樣本橋式擴增，在每個chip-seqlane上面得到足夠測序使用的核酸簇（cluster）；

5）利用Hiseq2000的laser imaging系統，Truseq SBS Kit v3-HS（200cycles）的帶標籤dNTP，記錄從測序接頭開始讀取的每個鹼基出現順序及頻次，測試核酸樣本鹼基；

6）下機取出數據，數據處理。

測序結果如圖3所示，序列如SEQIDNO.1所示：TCAGGCAGAGGCGATAGAGGCGATAGA，結合表2可以確定篩選得到的胰蛋白酶配體的結構如下：

根據該結構式，合成該化合物後進行檢測，檢測確定該化合物為胰蛋白酶抑制劑，其抑酶活性如圖4~5所示，IC50為8.1±2.1納摩爾/升，說明篩選得到的化合物確實為胰蛋白酶配體。

實驗結果說明，《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》構建了一個含有245個化合物的化學文庫，並篩選得到了一個胰蛋白酶配體，其具有抑制胰蛋白酶的活性，說明該發明方法可以有效合成並篩選先導化合物。

實施例3該發明先導化合物的合成和篩選試劑盒

1、《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》試劑盒的組成（N個合成砌塊的合成用量）

1）i種合成砌塊與i+2種單鏈DNA片段，將單鏈DNA片段分為始端序列、末端序列和i種標記序列，i種標記序列分別特意標記i種合成砌塊，其中，i=1，2，3…n；

2）始端序列與合成砌塊連線用試劑、組合化學方法合成用試劑和單鏈DNA片段連線用試劑；

3）化合物篩選用試劑；

4）DNA測序用試劑。

《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》試劑盒按照該發明實施例1提供的方法使用，可用於先導化合物的快速合成和篩選。

榮譽表彰

2016年12月7日，《一種先導化合物的合成及篩選方法與試劑盒》獲得第十八屆中國專利優秀獎。