《一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒及製備方法》是安徽大千生物工程有限公司於2014年4月18日申請的發明專利，該專利申請號為2014101592980，公布號為CN103940816A，專利公布日為2014年07月23日，發明人是芮雙印。
《一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒及製備方法》包括：甘膽酸R1試劑；甘膽酸R2試劑和甘膽酸校準品；該發明通過用偶聯在蛋白上的甘膽酸包被膠乳顆粒並懸浮在特定緩衝液中製作R2試劑。將甘膽酸首先通過化學鍵偶聯在大分子蛋白上，形成多個位點，而分子量較大的蛋白可以更好的與膠乳顆粒結合，偶聯有甘膽酸的蛋白進一步通過化學交聯方法包被在膠乳顆粒表面。該發明通過在特定緩衝液中加入甘膽酸-蛋白偶聯物製作R1試劑，特定緩衝液中要添加無機鹽、促凝劑、蛋白質和防腐劑。該發明試劑極大地提高了免疫反應的信號強度，使低含量物質在免疫結合時也能產生較強的濁度反應，以供檢測。
2020年7月17日，《一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒及製備方法》獲得安徽省第七屆專利獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒及製備方法
- 公布號：CN103940816A
- 公布日：2014年7月23日
- 申請號：2014101592980
- 申請日：2014年4月18日
- 申請人：安徽大千生物工程有限公司
- 地址：安徽省合肥市蜀山區新產業園井崗路自主創新產業基地6棟
- 發明人：芮雙印
- 代理機構：安徽省合肥新安專利代理有限責任公司
- 代理人：何梅生、王偉
- Int.Cl.：G01N21/82(2006.01)I；G01N33/531(2006.01)I
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
血清甘膽酸（Cholyglycine，CG）是膽酸與甘氨酸結合二次的結合型膽酸之一，在肝細胞內，膽固醇經過及其複雜的酶促反應，轉變成初級膽汁酸。其中有膽酸（CA）和鵝去氧膽酸（CD-CA）。膽酸的類固醇核上有三個羥基（C3、C7、C12），側鏈末端的羥基以肽鍵與甘氨酸結合，CG由肝細胞合成，經毛細膽管、膽管排入膽囊，隨同膽汁進入十二指腸，幫助食物消化。95％膽酸在迴腸末端重吸收，經門靜脈再回肝臟，由肝細胞攝取再利用。在血清中主要以蛋白結合形式存在。正常情況下，外周血中膽酸含量甚微，正常成人無論空腹或餐後，其血清CG濃度穩定在低水平。當肝細胞受損時，肝細胞攝取CG能力下降，致使血中CG含量增高；膽汁郁滯時，肝臟排泄膽酸發生障礙，而返流血液循環的CG含量增高，也使血CG含量增高。測定血清甘膽酸（CG）是評價肝細胞功能及其肝膽系物質循環功能的敏感指標之一。另外孕婦在懷孕的中後期，由於嬰兒的增大，會壓迫肝臟，使肝臟排泄膽酸發生障礙而導致甘膽酸偏高，另外由於妊娠期胎盤合成和分泌大量雌激素和孕激素以及代謝負荷增大，可誘發肝膽系統的變化，使孕婦易患妊娠肝內膽汁淤積症（ICP），對胎兒產生嚴重的影響，隨ICP患者血清CG增高使羊水污染率、早產率、胎兒宮內窘迫率及剖宮產率增高，嚴重者可導致嬰兒的死亡，因此測定孕婦血清甘膽酸，對及早發現ICP和了解ICP的嚴重程度有著非常重要的意義，甘膽酸的測定可作為篩查和隨訪ICP的指標。從而降低圍產兒病死率。甘膽酸是肝臟分泌到膽汁中最大量的有機酸，進入腸腔幫助脂肪消化吸收，在迴腸和結腸大部分被重吸收，經門靜脈入肝臟。肝細胞能高效能地從門靜脈攝取大量的甘膽酸，以致血液中的甘膽酸量小於1.9克/毫升。重吸收的甘膽酸又進入肝腸循環，通過這種機制，機體能充分利用甘膽酸。一旦肝細胞病變，血中的甘膽酸濃度升高，其中急性肝炎、慢性肝炎輕度升高，肝硬變，肝癌病人顯著升高。當肝細胞受損時，肝細胞攝取CG能力下降，致使血中CG含量增高；膽汁郁滯時，肝臟排泄膽酸發生障礙，而返流血液循環的CG含量增高，也使血CG含量增高。因此，測定血清甘膽酸（CG）是評價肝細胞功能及其肝膽系物質循環功能的敏感指標之一。
截至2014年4月，已知的甘膽酸測定方法有放射免疫法（RIA）、化學發光法、酶聯免疫吸附法（ELISA）法、膠乳增強比濁法等，放射免疫分析法步驟繁瑣，試劑價格昂貴，需使用配套的儀器且存在放射性污染。酶聯免疫吸附法存在檢測時間長、操作複雜、重複性差、不適於急診和臨床病人及時診斷的需要。2014年4月之前的膠乳增強免疫比濁法雖然操作簡單、快速、但是靈敏度低，低值重複性差。
發明內容
專利目的
《一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒及製備方法》為了避免2014年4月之前技術存在的不足之處，提供一種能夠套用到全自動化生化分析儀器上甘膽酸（CG）試劑盒及其製備方法。該試劑能夠快速、準確的檢測人血漿樣本中的甘膽酸含量。
技術方案
《一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒及製備方法》通過用偶聯在蛋白上的甘膽酸包被膠乳顆粒並懸浮在特定緩衝液中製作R2試劑。由於甘膽酸分子量非常小，只有一個抗原位點，不能製成膠乳試劑，抗原與抗體的反應不能形成膠聯而產生濁度，只能讓甘膽酸首先通過化學鍵偶聯在大分子蛋白上，形成多個位點，而分子量較大的蛋白可以更好的與膠乳顆粒結合，偶聯有甘膽酸的蛋白濃度為0.1-2.0毫克/毫升。偶聯有甘膽酸的蛋白進一步通過化學交聯方法包被在膠乳顆粒表面。 該發明通過在特定緩衝液中加入甘膽酸-蛋白偶聯物製作R1試劑，特定緩衝液中要添加無機鹽、促凝劑、蛋白質和防腐劑。所選擇的甘膽酸-蛋白複合體首先要通過間接ELISA方法檢測，確認不會產生非特異性反應。其中要求緩衝液的緩衝能力為調節pH範圍在7-9之間，可以選擇各種緩衝液，優選HEPES、甘氨酸、Tris等，與其他緩衝液相比，上述緩衝液具有緩衝能力強、溶解度高、很好的生物適應性和反應。其中Tris-HCl能較長時間控制恆定的pH範圍，因此更優選Tirs-HCl，其濃度範圍為10-100摩爾/升，pH範圍為7-8。促凝劑選擇PEG-6000，可以加快免疫反應速度，縮短檢測時間，其終濃度為2-6％。蛋白質選擇牛血清白蛋白，終濃度為0.1-1％。氯化鈉濃度為0.7-0.9％，疊氮鈉濃度為0.05-0.1％。 該發明通過在特定緩衝液中添加甘膽酸濃度分別為0、2.5、10、20、40、80微克/毫升製作多點校準品，其中要求緩衝液的緩衝能力為調節pH範圍在7-9之間，可以選擇各種緩衝液，優選HEPES、甘氨酸、Tris等，與其他緩衝液相比，具有緩衝能力強、溶解度高、很好的生物適應性和反應。其中Tris-HCl能較長時間控制恆定的pH範圍，因此更優選Tirs-HCl，其濃度範圍為10-200摩爾/升，pH範圍為7-8。其中含有特定的蛋白穩定劑如牛血清白蛋白濃度為0.1-1％，含有特定的防腐劑如PC-300濃度為0.05-0.5％，含有特定的抗氧化劑如EDTA-2Na濃度為5-50摩爾/升。
該發明提供用於測量在人血漿、血清樣品中的甘膽酸競爭免疫比濁測定方法，該方法是將含有甘膽酸的人血漿、血清樣本與甘膽酸-蛋白偶聯物競爭結合甘膽酸-蛋白抗體膠乳顆粒，與甘膽酸結合的甘膽酸-蛋白抗體膠乳顆粒不產生濁度，而與甘膽酸-蛋白偶聯物結合甘膽酸-蛋白抗體膠乳顆粒會產生濁度變化，甘膽酸與甘膽酸-蛋白抗體膠乳顆粒結合優於甘膽酸-蛋白偶聯物結合甘膽酸-蛋白抗體膠乳顆粒結合的效率，估樣本中甘膽酸含量越高，反應所產生的濁度越低。下降的程度與人血漿、血清中的甘膽酸含量成正比，使用全自動生化分析儀器可以計算出人血漿、血清樣本中甘膽酸的含量。
該發明具體技術方案如下：
一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒，其特點在於包括：甘膽酸R1試劑；甘膽酸R2試劑和甘膽酸校準品；
所述甘膽酸R1試劑由甘膽酸-蛋白偶聯物和緩衝液組成，所述緩衝液為濃度10-100摩爾/升的Tirs-HCl溶液，所述緩衝液的pH值為7-8；所述緩衝液中含有濃度2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化鈉、0.05-0.1wt％的疊氮鈉、0.3wt％的PC-300、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20摩爾/升EDTA；所述甘膽酸R1試劑中甘膽酸-蛋白偶聯物的濃度為0.05-2毫克/毫升；所述甘膽酸-蛋白偶聯物是通過偶聯劑將甘膽酸和蛋白偶聯後獲得；所述甘膽酸-蛋白偶聯物中蛋白濃度為0.1-2.0毫克/毫升；
所述甘膽酸R2試劑由懸浮緩衝液和甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒組成，所述懸浮緩衝液為含有穩定劑和防腐劑的濃度為20-100摩爾/升的甘氨酸-Na0H緩衝液；所述穩定劑由終濃度0.1-1.0wt％的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt％的氯化鈉、5-50摩爾/升的乙二胺四乙酸二鈉、體積濃度0.1-1.0％TX-100組成；所述防腐劑為PC-300，終體積濃度為0.05-0.1％；所述甘膽酸R2試劑中甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒的質量分數為0.05-1.0％； 所述甘膽酸校準品是由人源性甘膽酸和緩衝液組成，所述緩衝液為濃度50-200摩爾/升的Tirs-HCl溶液，所述緩衝液中含有終濃度0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt％的PC-300、5-50摩爾/升的乙二胺四乙酸二鈉；所述甘膽酸校準品包括人源性甘膽酸濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80微克/毫升的一組校準品；
該發明試劑盒，其特點還在於：
與甘膽酸偶聯的蛋白選自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛轉鐵蛋白、血藍蛋白中的一種亞型或多種亞型的混合；所述偶聯劑選自碳化二亞胺、戊二醛、二異氰酸化合物或二鹵化二硝基苯中的一種或多種。
所述膠乳顆粒為核殼結構，直徑範圍為100-450納米，濃度為1-5毫克/毫升；所述膠乳顆粒的表面帯有由羧基、氨基、羥基、醯肼基或氯甲基修飾的化學基團；所述甘膽酸-蛋白抗體與膠乳顆粒本身攜帶的化學基團通過化學鍵結合在膠乳顆粒表面。
該發明同時公開了一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒的製備方法，其特點征在於包括如下步驟：
一、甘膽酸-蛋白偶聯物的製備：
1）準確稱取2毫克甘膽酸，將其溶解在100微升DMF試劑中，所得溶液為A液；用DMF配製89.4毫克/毫升的NHS溶液，所的溶液為B液；用DMF配製60.2毫克/毫升的二環己基碳二亞胺溶液，所得溶液為C液；稱取16毫克血藍蛋白，將其溶解在1毫升pH7.2、濃度0.02摩爾/升磷酸鹽緩衝液中；所得溶液為D液；
2）分別取B液和C液各30.7微升加到100微升A液中，室溫下攪拌90分鐘；
3）將攪拌完畢的混合液加到D液中，在4℃條件下攪拌12小時；
4）將步驟3）處理的反應液放入pH7.4、濃度0.01摩爾/升磷酸鹽緩衝液中透析12小時，即得到甘膽酸-蛋白偶聯物；
二、甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒製備：
1）以步驟一所得的甘膽酸-蛋白偶聯物皮下免疫小鼠；選擇免疫後血清效價大於10000的小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，通過BSA-CG板篩選得到甘膽酸單克隆細胞抗體；
2）把1.5克膠乳顆粒加入150毫升pH5.5、濃度80摩爾/升的2-嗎啉代乙磺酸緩衝液中，攪拌30分鐘；然後添加0.067毫克/毫升的碳化二亞胺20毫升以及0.033毫克/毫升的N羥基琥珀醯亞胺20毫升，常溫反應45分鐘；
3）把經步驟2）反應後的混合物，以15000轉/mim離心15分鐘，去上清液，然後用150毫升pH8.2、濃度0.1摩爾/升的磷酸鹽緩衝液重懸；得到膠乳顆粒混懸液；
4）將所得的膠乳顆粒混懸液重複步驟3），重複後所得到的膠乳顆粒混懸液進行清洗；清洗後，用濃度0.1摩爾/升的磷酸鹽緩衝液把體積調整至700毫升；
5）將180毫克甘膽酸單克隆細胞抗體加入到300毫升pH8.2、0.1摩爾/升磷酸緩衝液中，攪拌均勻；加入到步驟4）的膠乳溶液中；然後置於37度的搖床中，反應2-4個小時；再加入0.5克/毫升甘氨酸10毫升，再次反應30分鐘；
6）步驟5）反應結束後，將5克牛血清白蛋白加到上述混合液中，攪拌均勻後，室溫放置12小時；然後9000轉/mim離心15分鐘，去上清液，用500毫升pH8.2、濃度0.1摩爾/升的磷酸鹽緩衝液重懸；得膠乳顆粒混懸液；
7）將所得到的膠乳顆粒混懸液再經9000轉/mim離心15分鐘，去上清液，用500毫升pH8.2、濃度0.1摩爾/升的磷酸鹽緩衝液重懸；將再次重懸後所得的膠乳顆粒混懸液用pH8.2、濃度0.1摩爾/升的磷酸鹽緩衝液把體積調整至1000毫升；所得溶液即為甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒；
三、甘膽酸R1試劑的製備
將步驟一製備獲得的甘膽酸-蛋白偶聯物與緩衝液充分混合即得甘膽酸R1試劑，所述緩衝液為濃度10-100摩爾/升的Tirs-HCl溶液，所述緩衝液的pH值為7-8；所述緩衝液中含有濃度2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化鈉、0.05-0.1wt％的疊氮鈉、0.3wt％的PC-300、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20摩爾/升EDTA；所述甘膽酸R1試劑中甘膽酸-蛋白偶聯物的濃度為0.05-2毫克/毫升；
四、甘膽酸R2試劑的製備
將步驟二製備獲得的甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒與懸浮緩衝液混合即得甘膽酸R2試劑，所述懸浮緩衝液為含有穩定劑和防腐劑的濃度為20-100摩爾/升的甘氨酸-Na0H緩衝液；所述穩定劑由終濃度0.1-1.0wt％的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt％的氯化鈉、5-50摩爾/升的乙二胺四乙酸二鈉、體積濃度0.1-1.0％TX-100組成；所述防腐劑為PC-300，終體積濃度為0.05-0.1％；所述甘膽酸R2試劑中甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒的質量濃度為0.05-1.0％。
五、甘膽酸校準品的製備
向緩衝液中加入不同量的人源性甘膽酸得到濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80微克/毫升的一組校準品；所述緩衝液為濃度0-200摩爾/升的Tirs-HCl溶液，所述緩衝液中含有終濃度0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt％的PC-300、5-50摩爾/升的乙二胺四乙酸二鈉。
改善效果
《一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒及製備方法》有益效果體現在：
1、該發明膠乳比濁試劑極大地提高了免疫反應的信號強度，使低含量物質在免疫結合時也能產生較強的濁度反應，以供檢測。
2、該發明競爭免疫比濁測定方法的好處在於抗干擾性更強，與傳統免疫比濁法試劑相比，在低值部分信號強度更大，因人體中甘膽酸的正常範圍是0-2.5微克/毫升，低值部分的準確性，對於臨床套用來說是最重要的部分，競爭法試劑就讓低值測試的重複性和準確性得到了極大的提高。
3、該發明基於一個特異性針對甘膽酸的單克隆抗體和交聯有甘膽酸-人血清白蛋白的膠乳顆粒懸浮液，在特定的反應體系中發生抗原抗體反應形成一定的濁度，能夠被基於分光光度計的生化分析儀檢測到。而人血漿中如果有游離狀態的甘膽酸存在，會與固定在膠乳顆粒表面的甘膽酸競爭結合單克隆抗體，使濁度下降，通過測定反應後體系濁度的降低程度來對甘膽酸進行定量分析。
4、該發明同時解決了甘膽酸檢測的特異性和自動化程度低的問題，可以廣泛推廣套用。
附圖說明
圖1是《一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒及製備方法》檢測結果相關性線性回歸方程。
圖2是該發明試劑盒對甘膽酸純品檢測的線性回歸方程。
技術領域
《一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒及製備方法》涉及生物化學技術領域，具體涉及一種採用免疫競爭法、膠乳增強比濁法測定人體中甘膽酸（CG）含量的試劑及其製備方法。
權利要求
1.一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒，其特徵在於包括：甘膽酸R1試劑；甘膽酸R2試劑和甘膽酸校準品；
所述甘膽酸R1試劑由甘膽酸-蛋白偶聯物和緩衝液組成，所述緩衝液為濃度10-100摩爾/升的Tirs-HCl溶液，所述緩衝液的pH值為7-8；所述緩衝液中含有濃度2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化鈉、0.05-0.1wt％的疊氮鈉、0.3wt％的PC-300、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20摩爾/升EDTA；所述甘膽酸R1試劑中甘膽酸-蛋白偶聯物的濃度為0.05-2毫克/毫升；所述甘膽酸-蛋白偶聯物是通過偶聯劑將甘膽酸和蛋白偶聯後獲得；所述甘膽酸-蛋白偶聯物中蛋白濃度為0.1-2.0毫克/毫升；
所述甘膽酸R2試劑由懸浮緩衝液和甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒組成，所述懸浮緩衝液為含有穩定劑和防腐劑的濃度為20-100摩爾/升的甘氨酸-Na0H緩衝液；所述穩定劑由終濃度0.1-1.0wt％的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt％的氯化鈉、5-50摩爾/升的乙二胺四乙酸二鈉、體積濃度0.1-1.0％TX-100組成；所述防腐劑為PC-300，終體積濃度為0.05-0.1％；所述甘膽酸R2試劑中甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒的質量分數為0.05-1.0％；
所述甘膽酸校準品是由人源性甘膽酸和緩衝液組成，所述緩衝液為濃度50-200摩爾/升的Tirs-HCl溶液，所述緩衝液中含有終濃度0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt％的PC-300、5-50摩爾/升的乙二胺四乙酸二鈉；所述甘膽酸校準品包括人源性甘膽酸濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80微克/毫升的一組校準品。
2.根據權利要求1所述的一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒，其特徵在於，與甘膽酸偶聯的蛋白選自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛轉鐵蛋白、血藍蛋白中的一種亞型或多種亞型的混合；所述偶聯劑選自碳化二亞胺、戊二醛、二異氰酸化合物或二鹵化二硝基苯中的一種或多種。
3.根據權利要求1所述的一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒，其特徵在於，所述膠乳顆粒為核殼結構，直徑範圍為100-450納米，濃度為1-5毫克/毫升；所述膠乳顆粒的表面帯有由羧基、氨基、羥基、醯肼基或氯甲基修飾的化學基團；所述甘膽酸-蛋白抗體與膠乳顆粒本身攜帶的化學基團通過化學鍵結合在膠乳顆粒表面。
實施方式
- 實施例1：肝膽酸-蛋白偶聯物製備
一、試劑準備：
A液：準確稱取2毫克甘膽酸，將其溶解在100微升DMF試劑中；B液：用DMF配製89.4毫克/毫升的NHS溶液；C液：用DMF配製60.2毫克/毫升的DCC（二環己基碳二亞胺）溶液；D液：稱取16毫克BSA（牛血清白蛋白），將其溶解在1毫升pH為7.2的0.02摩爾/升磷酸鹽緩衝液溶液中。
該發明實施例中的磷酸鹽緩衝液均選自市售磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉或磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩衝液。
二、試劑配置：
1、分別取B液和C液各30.7微升加到100微升A液中，室溫下攪拌90分鐘。
2、攪拌完畢的混合液加到D液中並劇烈混合，在4℃條件下攪拌12小時。
3、把反應液放入pH為7.4濃度0.01摩爾/升PBS溶液中透析12小時，即得到甘膽酸-蛋白偶聯物。
三、肝膽酸-蛋白複合體的鑑定：
1、人工合成抗原的紫外鑑定用紫外分光光度法對BSA標準品、偶聯產物和甘膽酸進行紫外掃描，根據偶聯產物最大吸收峰的位移判斷是否偶聯成功。如果最大吸收峰與BSA標準品或甘膽酸一致的話，表示未偶聯成功，若偶聯產物最大吸收峰與BSA標準品最大吸收峰產生偏移，則表示偶聯成功。採用該發明方法所得偶聯產物收率為80％。
- 實施例2：甘膽酸單抗製備
1、製備
以KLH蛋白偶聯CG後皮下免疫BalB/c小鼠（BalB/c為市售小鼠品種），經過四次免疫（一次初免三次加強免疫），取免疫效果理想（即採用間接ELISA法鑑定免疫後血清效價大於10000的）的BalB/c小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞（由ATCC提供）進行融合，通過BSA-CG板篩（截至2014年4月已有的儀器）選得到甘膽酸單克隆細胞抗體。
2、關於肝膽酸單克隆抗體的篩選以及鑑定
鑑定小分子單抗，選用“BSA-CG包被ELISA板”通過競爭ELISA實驗，與游離CG有競爭抑制反應的抗體就是特異性針對CG的單抗。競爭關係越明顯，說明對CG親和力越高，反之說明親和力越弱。
- 實施例3：肝膽酸-蛋白抗體與乳膠反應物製備
1、把1.5克乳膠顆粒（該顆粒為核殼結構，其乳核是聚苯乙烯聚合物，乳殼由苯乙烯、丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸共聚物組成，其表面所帯的化學基團不同可以選自羧基、氨基、羥基、醯肼基、氯甲基修飾的一種；膠乳顆粒直徑範圍為100-450納米，市場購買獲得，如JSR公司提供的型號為P0220型羧基微球）加入pH為5.5，濃度為80毫摩爾/升的2-嗎啉代乙磺酸緩衝液150毫升中，攪拌30分鐘；
2、往上述溶液中，添加碳化二亞胺20毫升（濃度為0.067毫克/毫升）以及N羥基琥珀醯亞胺20毫升（濃度為0.033毫克/毫升），反應45分鐘。
3、把上述混合物，放置在轉速為15000轉/mim離心15分鐘，去掉上清液，用pH為8.2，濃度為0.1摩爾/升的磷酸鹽緩衝液150毫升重懸。如溶液無法立即重懸，可以使用超聲儀器對溶液進行超聲。
4、重複第3步，重懸後所得膠乳顆粒混懸液，用pH為8.2，濃度為0.1摩爾/升的磷酸鹽緩衝液把體積調整至700毫升。
5、把180毫克甘膽酸單克隆細胞抗體加入到300毫升pH8.2、0.1摩爾/升磷酸緩衝液中，攪拌均勻。然後緩慢的加入到第4步的膠乳溶液中。
6、抗體添加完畢後，把上述乳膠混合物置於37度的搖床中，反應2-4個小時。
7、反應完全後，把0.5克/毫升甘氨酸10毫升加到上述混合中，反應30分鐘
8、反應完全後，把5克牛血清白蛋白加到上述混合中，攪拌均勻後，室溫放置12小時。9、把上述混合物，放置在轉速為9000轉/mim離心15分鐘，去掉上清液，用pH為8.2，濃度為0.1摩爾/升的磷酸鹽緩衝液500毫升重懸，得到膠乳顆粒混懸液。如溶液無法立即重懸，可以使用超聲儀器對溶液進行超聲。
10、將所得到的膠乳顆粒混懸液再經9000轉/mim離心15分鐘，去上清液，用500毫升pH8.2、濃度0.1摩爾/升的磷酸鹽緩衝液重懸；將再次重懸後所得的膠乳顆粒混懸液用pH8.2、濃度0.1摩爾/升的磷酸鹽緩衝液把體積調整至1000毫升；所得溶液即為甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒。
- 實施例4：甘膽酸R1試劑的製備
將步驟一製備獲得的甘膽酸-蛋白偶聯物與緩衝液充分混合即得甘膽酸R1試劑，所述緩衝液為濃度10-100摩爾/升的Tirs-HCl溶液，所述緩衝液的pH值為7-8；所述緩衝液中含有濃度2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化鈉、0.05-0.1wt％的疊氮鈉、0.3wt％的PC-300（市售產品，supelco公司，商品名proclin300）、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20摩爾/升EDTA；所述甘膽酸R1試劑中甘膽酸-蛋白偶聯物的濃度為0.05-2毫克/毫升；
- 實施例5：甘膽酸R2試劑的製備
將步驟二製備獲得的甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒與懸浮緩衝液混合即得甘膽酸R2試劑，所述懸浮緩衝液為含有穩定劑和防腐劑的濃度為20-100摩爾/升的甘氨酸-Na0H緩衝液；所述穩定劑由終濃度0.1-1.0wt％的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt％的氯化鈉、5-50摩爾/升的乙二胺四乙酸二鈉、體積濃度0.1-1.0％TX-100組成；所述防腐劑為PC-300，終體積濃度為0.05-0.1％；所述甘膽酸R2試劑中甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒的質量濃度為0.05-1.0％。
- 實施例6：甘膽酸校準品的製備
向緩衝液中加入不同量的人源性甘膽酸得到濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80微克/毫升的一組校準品；所述緩衝液為濃度0-200摩爾/升的Tirs-HCl溶液，所述緩衝液中含有終濃度0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt％的PC-300、5-50摩爾/升的乙二胺四乙酸二鈉。 以上實施例中所用防腐劑選自疊氮鈉、硫柳汞、PC-300和乙基汞硫代硫酸鈉中的一種或兩種以上。促凝劑選自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖鈉、聚乙烯吡絡烷酮中的一種。
三、試劑盒的測定方法
分析方法：兩點終點法
反應方向：上升反應
校準方式：logit-log（4p）或SPLINE
測定波長：570納米
測定溫度：37℃
樣本：甘膽酸R1試劑：甘膽酸R2試劑＝5:200:50（微升）
操作步驟：將200微升試劑R1加入5微升樣本，37℃孵育5分鐘後加入50微升試劑R2，1分鐘後讀取吸光度A1，3分鐘後讀取吸光度A2。
採用6點定標法，用日立7180全自動生化分析儀進行檢測，校準品濃度分別為：0、2.5、10、20、40、80微克/毫升。
四、試劑盒的性能評價實驗
1、線性相關性
將實施例4-6製備的該發明試劑盒與市售甘膽酸化學發光法檢測試劑盒A對比檢測102份血清樣本，比較該發明試劑盒與市售甘膽酸化學發光法檢測試劑盒檢測結果的相關性。（結果見圖1，X，Y軸均為測定值，單位毫克/升。）相關係數r＝0.9940，線性回歸方程為：y＝1.019x-0.014，結果表明該發明試劑與酶聯免疫試劑盒檢測結果相關性較好。實驗數據如表1所示，回歸方程見附圖1。
序號 | 對照實際 | 對比結果1 | 序號 | 對照實際 | 對比結果1 | 序號 | 對照實際 | 對比結果1 | 序號 | 對照實際 | 對比結果1 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
1 | 0.23 | 0.25 | 26 | 0.38 | 0.36 | 51 | 0.2 | 0.21 | 77 | 7.31 | 6.66 |
2 | 0.1 | 0.11 | 27 | 0.4 | 0.4 | 52 | 0.21 | 0.2 | 78 | 14.47 | 15.26 |
3 | 0.28 | 0.29 | 28 | 0.16 | 0.14 | 53 | 0.26 | 0.24 | 79 | 2.94 | 2.96 |
4 | 0.38 | 0.34 | 29 | 0.45 | 0.47 | 54 | 0.32 | 0.3 | 80 | 9.45 | 9.86 |
5 | 0.27 | 0.3 | 30 | 0.23 | 0.24 | 55 | 0.33 | 0.36 | 81 | 7.95 | 8.03 |
6 | 0.37 | 0.39 | 31 | 0.37 | 0.4 | 56 | 0.25 | 0.23 | 82 | 9.79 | 10.22 |
7 | 0.39 | 0.36 | 32 | 0.29 | 0.31 | 57 | 0.2 | 0.19 | 83 | 13.09 | 12.72 |
8 | 0.22 | 0.22 | 33 | 0.28 | 0.27 | 58 | 0.46 | 0.43 | 84 | 3.41 | 3.25 |
9 | 0.38 | 0.4 | 34 | 0.34 | 0.37 | 59 | 0.25 | 0.28 | 85 | 1.27 | 1.23 |
10 | 0.31 | 0.29 | 35 | 0.11 | 0.11 | 60 | 0.4 | 0.37 | 86 | 6.15 | 6.1 |
11 | 0.15 | 0.14 | 36 | 0.26 | 0.26 | 61 | 0.2 | 0.19 | 87 | 7.58 | 7.43 |
12 | 0.24 | 0.24 | 37 | 0.13 | 0.13 | 62 | 0.37 | 0.4 | 88 | 8.18 | 8.64 |
13 | 0.33 | 0.36 | 38 | 0.27 | 0.27 | 63 | 0.38 | 0.39 | 89 | 18.61 | 18.8 |
14 | 0.29 | 0.26 | 39 | 0.38 | 0.38 | 64 | 0.12 | 0.12 | 90 | 14.16 | 13.95 |
15 | 0.24 | 0.24 | 40 | 0.17 | 0.17 | 65 | 0.23 | 0.2 | 91 | 2.67 | 2.54 |
16 | 0.36 | 0.34 | 41 | 0.2 | 0.22 | 66 | 0.1 | 0.1 | 92 | 11.22 | 11.66 |
17 | 0.14 | 0.16 | 42 | 0.18 | 0.18 | 67 | 0.45 | 0.4 | 93 | 18.44 | 18.5 |
18 | 0.4 | 0.36 | 43 | 0.22 | 0.21 | 68 | 0.31 | 0.27 | 94 | 2.75 | 2.92 |
19 | 0.2 | 0.21 | 44 | 0.37 | 0.39 | 69 | 0.14 | 0.13 | 95 | 9.43 | 10.22 |
20 | 0.21 | 0.19 | 45 | 0.44 | 0.46 | 70 | 0.37 | 0.34 | 96 | 4.18 | 4.5 |
21 | 0.45 | 0.42 | 46 | 0.14 | 0.12 | 71 | 16.39 | 15.5 | 97 | 12.33 | 13.83 |
22 | 0.34 | 0.34 | 47 | 0.3 | 0.3 | 72 | 14.35 | 15.99 | 98 | 8.22 | 7.49 |
23 | 0.29 | 0.31 | 48 | 0.17 | 0.16 | 73 | 14.04 | 12.4 | 99 | 0.32 | 0.33 |
24 | 0.23 | 0.23 | 49 | 0.41 | 0.38 | 74 | 17.31 | 19.39 | 100 | 13.38 | 13.43 |
25 | 0.32 | 0.33 | 50 | 0.43 | 0.41 | 75 | 7.53 | 7.73 | 101 | 15.8 | 15.86 |
76 | 0.28 | 0.29 | 102 | 0.21 | 0.2 | - | |||||
2、線性範圍實驗
用甘膽酸純品配製成濃度160毫克/升的高值樣本，用生理鹽水分別稀160毫克/升、80毫克/升、40毫克/升、20毫克/升、10毫克/升、5毫克/升、2.5毫克/升、1.25毫克/升、0.5毫克/升、0毫克/升（水）。按照試劑盒各自的檢測方法，每個樣本重複測定三次，求出測定結果的均值（yi）。以稀釋濃度（xi）為自變數，以測定結果均值（yi）為因變數求出線性回歸方程，如圖2所示，計算線性回歸的相關係數（r）。以稀釋濃度（xi）代入求出線性回歸方程，計算yi的估計值及yi與估計值的相對偏差。結果表明該發明試劑盒線性範圍可達100毫克/升，yi的估計值及yi與估計值的相對偏差均小於10％，見表2。
序號 | 相對濃度 | 1 | 2 | 3 | 平均數 | 絕對偏差 | 相對偏差 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
1 | 160 | 161 | 163.5 | 162.3 | 162.22 | 2.33 | 1.44% |
2 | 80 | 80.33 | 81.3 | 80.81 | 80.81 | 0.81 | 1% |
3 | 40 | 42.3 | 40.8 | 42.08 | 41.73 | 1.73 | 4.14% |
4 | 20 | 20.33 | 20.05 | 20.14 | 20.18 | 0.18 | 0.87% |
5 | 10 | 9.79 | 10.12 | 10.26 | 10.06 | 0.06 | 0.57% |
6 | 5 | 4.9 | 4.95 | 4.84 | 4.9 | 0.1 | 2.11% |
7 | 2.5 | 2.4 | 2.47 | 2.61 | 2.49 | 0.01 | 0.22% |
8 | 1.25 | 1.29 | 1.24 | 1.24 | 1.26 | 0.01 | 0.74% |
9 | 0.5 | 0.5 | 0.51 | 0.48 | 0.5 | 0 | 0.55% |
10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | - |
3、準確度
取具有溯源性的血清高值質控和低值質控各一份，用發明試劑盒進行檢測六次，求均值，與質控靶值進行對照。結果表明，檢測結果均值接近靶值，相對偏差較小，準確度較好。結果見表3。
測定值 | 平均值 | 定製血清濃度 | 相對誤差 |
|---|---|---|---|
1.19 | 1.23 | 1.25 | 1.36% |
1.19 | |||
1.18 | |||
1.32 | |||
1.35 | |||
1.17 | |||
測定值 | 平均值 | 定製血清濃度 | 相對誤差 |
67 | 63.8 | 63.5 | 0.47% |
667.57 | |||
59.38 | |||
58.5 | |||
67.88 | |||
62.3 | |||
67.14 |
4、精密度
選取低值血清樣本和高值血清樣本各一份，使用試劑盒對同一份血清樣本連續測定10次，計算試劑盒檢測樣本的變異係數。精密度實驗數據如表4所示：檢測結果表明，發明試劑盒檢測高值、低值樣本變異係數分別為：4.80％、2.08％，精密度較好。該試劑盒的突出優點是在低值部分有著更好的精密度，從而滿足了樣本在低值區域的重複性、準確度更好的臨床需求。數據見表4。
測試次數 | 結果（高值） | 結果（低值） |
|---|---|---|
1 | 31.54 | 0.85 |
2 | 32.23 | 0.84 |
3 | 28.75 | 0.86 |
4 | 31.83 | 0.88 |
5 | 28.94 | 0.86 |
6 | 29.1 | 0.85 |
7 | 31.13 | 0.88 |
8 | 29.23 | 0.87 |
9 | 28.71 | 0.82 |
10 | 31.47 | 0.86 |
平均值 | 30.29 | 0.86 |
SD | 1.453 | 0.018 |
CV | 4.80% | 2.08% |
榮譽表彰
2020年7月17日，《一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒及製備方法》獲得安徽省第七屆專利獎優秀獎。
