《一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法》是中國醫科大學於2010年8月13日申請的發明專利，該專利申請號為2010102522012，公布號為CN101914490A，公布日為2010年12月15日，發明人是龐希寧、劉曉玉、霍雙枝、施萍。
《一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法》涉及一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法。該培養基為DMEM/F12基礎培養基中添加人血清白蛋白、人轉鐵蛋白、人胰島素和亞硒酸鈉；其培養方法是將人羊膜先用胰蛋白酶消化，然後用膠原酶IV及脫氧核糖核酸酶I消化，過濾製成單細胞懸液；再通過VDMEM:VF12＝1:1的DMEM/F12基礎培養基中添加人血清白蛋白、轉鐵蛋白、胰島素和亞硒酸鈉，使人羊膜間充質幹細胞在無血清條件下，置於37攝氏度、飽和濕度、體積分數為5％的CO2培養箱中，通過換液和傳代，實現體外培養和擴增，並維持多向分化的潛能，擴增後的細胞能夠在體外誘導成軟骨細胞、成骨細胞和脂肪細胞。具有無其他動物源性、來源廣泛、不受倫理限制的特點。
2021年6月24日，《一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法》獲得第二十二屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法
- 申請人：中國醫科大學
- 發明人：龐希寧、劉曉玉、霍雙枝、施萍
- 申請號：2010102522012
- 申請日：2010年8月13日
- 公布號：CN101914490A
- 公布日：2010年12月15日
- 地址：遼寧省瀋陽市和平區北二馬路92號
- 代理機構：瀋陽智龍專利事務所（普通合夥）
- 代理人：宋鐵軍
- Int. Cl.：C12N5/0735
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,實施案例,實例結果,專利榮譽,
專利背景
2010年前，再生醫學蓬勃發展，幹細胞的研究取得了重大突破。使用幹細胞來生成機體組織和器官以替代人體喪失功能的器官和組織來達到治療目的已逐步成為現實。幹細胞很可能在醫學領域引發革命性進步，因而具有不可估量的醫學價值而引起全世界的廣泛關注和研究。是21世紀最具有發展和套用前景的領域。再生醫學需要具備三個必要的條件：（1）幹細胞，即具有高度的自我更新、增殖和分化能力，能夠修復受損器官組織的細胞；（2）支架，支持細胞的生長；（3）生長和分化因子，促進細胞增殖和分化。其中幹細胞起著舉足輕重的作用，人們最早發現胚胎幹細胞是能夠無限增殖並且向三個胚層分化，但是胚胎幹細胞存在倫理問題。
間充質幹細胞（mesenchymal stem cells，簡稱MSCs）是來源於成熟組織中的多能幹細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，是細胞移植和組織工程的新型種子細胞，具有廣闊的套用前景。其中，研究最為廣泛的MSCs是來源於骨髓的間充質幹細胞，儘管其倫理問題與胚胎幹細胞相比大為減少，但骨髓細胞必須通過侵入的途徑獲得，及其隨著年齡的增長，幹細胞數量顯著減少。許多研究機構已經在其它組織中尋找到多能幹細胞，包括動員的外周血、臍血、乳牙、臍帶、羊膜間充質細胞，然而，從這些組織中得到的細胞在培養過程中仍在使用胎牛血清進行培養，存在異種免疫原性方面的實際問題，限制了臨床廣泛套用。
發明內容
專利目的
《一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法》針對幹細胞來源或者受倫理限制或者數量有限的問題，而提供同種異體、來源廣泛、變廢為寶，不受倫理限制及無免疫原性問題的一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法。
技術方案
一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基，包括：基礎培養基DMEM/F12：15.0-15.6克/升；人血清白蛋白：5.0-10×10％體積分數；人轉鐵蛋白：1.0-5.5×10克/升；人胰島素：5.0-10×10克/升；亞硒酸鈉：5.2-6.7×10克/升。
一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養方法，包括以下步驟：
（1）人羊膜間充質幹細胞分離及單細胞懸液的製備
取人羊膜5×5平方厘米，儘量剪碎，先用終濃度1.25-2.5克/升胰蛋白酶，室溫消化30-60分鐘，共2-4次，然後用DMEM/F12培養液中止胰蛋白酶，採用含加入終濃度為1.0-2.0克/升膠原酶IV和0.1-0.2克/升脫氧核糖核酸酶I的VDMEM:VF12＝1:1的DMEM/F12培養液，37攝氏度消化30-60分鐘，得到細胞懸液；將細胞懸液過濾，製成單細胞懸液；
（2）人羊膜間充質幹細胞無血清培養、純化及擴增
將第（1）步所得細胞接種於培養基中，置於37攝氏度、飽和濕度、體積分數為5％的CO2，培養箱中進行培養，並通過換液和傳代，使人羊膜間充質幹細胞逐漸得到擴增和純化；
所述培養基採用VDMEM:VF12＝1:1的DMEM/F12無血清培養基15.0-15.6克/升，其中含有體積分數5.0-10×10％人血清白蛋白，1.0-5.5×10克/升人轉鐵蛋白，5.0-10×10克/升人胰島素，5.2-6.7×10克/升亞硒酸鈉。
在上述第（2）步中，擇優選擇將第（1）步所得細胞以2×10升-2×10升密度接種於培養基中培養。
將細胞擴增和純化的過程優選如下：在第（2）步開始細胞培養後，培養48-72小時，更換培養液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，每2-3天全量換液一次，待細胞達到80％-90％融合時，用終濃度2.5克/升胰蛋白酶消化，然後按1:2的比例或1:3的比例進行傳代接種培養，並記為P1代，傳代培養過程中每2-3天全量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，重複上述操作進行傳代培養，並記為P2代，繼續上述傳代培養過程。
改善效果
人羊膜是胎兒出生以後的廢棄物，《一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法》從人羊膜體外無血清培養人羊膜間充質幹細胞（Human Amniotic mesenchymal stem cells，簡稱HAMSCs），與用含有胎牛血清的培養液培養人羊膜間充質幹細胞相比，具有無其他動物源性、來源廣泛、不受倫理限制及異種免疫原性等優越性。
附圖說明
圖1（P0-P5）為原代培養的HAMSCs倒置顯微鏡（×40）圖。
圖2-1為流式細胞術鑑定HAMSCs中分化抗原簇（cluster of differentiation，簡稱CD）44的表達圖。
圖2-2為流式細胞術鑑定HAMSCs中CD90的表達圖。
圖2-3為流式細胞術鑑定HAMSCs中CD105的表達圖。
圖3-1為HAMSCs細胞的CD44免疫螢光染色（×100）圖。
圖3-2為HAMSCs細胞的CD73免疫螢光染色（×40）圖。
圖3-3為HAMSCs細胞的CD90免疫螢光染色（×100）圖。
圖3-1為體外誘導HAMSCs分化為脂肪細胞（×100）圖。
圖4-2為體外誘導HAMSCs分化為成骨細胞（×100）圖。
圖4-3為體外誘導HAMSCs分化為軟骨細胞（×100）圖。
技術領域
《一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法》屬於生物技術領域的一種間充質幹細胞培養基及其培養方法，具體涉及的是一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法。
權利要求
1.一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基，包括：基礎培養基DMEM/F12：15.0-15.6克/升；人血清白蛋白：5.0-10×10％體積分數；人轉鐵蛋白：1.0-5.5×10克/升；人胰島素：5.0-10×10克/升；亞硒酸鈉：5.2-6.7×10克/升。
2.一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養方法，包括以下步驟：
（1）人羊膜間充質幹細胞分離及單細胞懸液的製備
取人羊膜先用終濃度2.5克/升胰蛋白酶，室溫消化30-60分鐘，共2-4次，然後用VDMEM:VF12＝1:1的DMEM/F12培養液中止胰蛋白酶，採用含加入終濃度為1.0-2.0克/升膠原酶IV和0.1-0.2克/升脫氧核糖核酸酶I的DMEM/F12培養液，37攝氏度消化30-60分鐘，得到細胞懸液；將細胞懸液過濾，製成單細胞懸液；
（2）人羊膜間充質幹細胞的無血清培養、純化及擴增
將第（1）步所得細胞接種於培養基中，置於37攝氏度、飽和濕度、體積分數為5％的CO2培養箱中進行培養，並通過換液和傳代，使人羊膜間充質幹細胞逐漸得到擴增和純化；所述培養基採用VDMEM:VF12＝1:1的DMEM/F12無血清培養基15.0-15.6克/升，其中含有體積分數5.0-10×10％人血清白蛋白，1.0-5.5×10克/升人轉鐵蛋白，5.0-10×10克/升人胰島素，5.2-6.7×10克/升亞硒酸鈉；在上述第（2）步中，將第（1）步所得細胞以2×10升-2×10升密度接種於培養基中培養；將細胞擴增和純化的過程如下：在第（2）步開始細胞培養後，培養48-72小時，更換培養液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，2-3天全量換液一次，待細胞達到80％-90％融合時，用終濃度2.5克/升胰蛋白酶消化，然後按1:2的比例或1:3的比例進行傳代接種培養，並記為P1代，傳代培養過程中每2-3天全量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，重複上述操作進行傳代培養，並記為P2代，繼續上述傳代培養過程。
實施方式
實施案例
- 實施例1
一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基，包括：基礎培養基DMEM/F12：15.6克/升（按體積1:1混合取15.6克溶於1000毫升水中，供應商GIBCO）；人血清白蛋白：8.0×10％；人轉鐵蛋白：5.0×10克/升；人胰島素：8.0×10克/升；亞硒酸鈉：6.0×10克/升；製成為水溶液。
- 實施例2
一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養方法，包括以下步驟：
1、人羊膜間充質幹細胞的分離及單細胞懸液的製備
在無菌條件下取正常足月剖腹產胎兒（男性）的人胎盤；檢測A型肝炎抗體、B型肝炎病毒表面抗原、B型肝炎病毒表面抗體、B型肝炎病毒e抗原、B型肝炎病毒e抗體、B型肝炎核心抗體IgM、C型肝炎抗體、戊型肝炎抗體、愛滋病病毒抗體、梅毒螺旋體抗體等其他相關傳染性指標均呈陰性；在無菌超淨台上鈍性分離胎盤臍帶面的羊膜5×5平方厘米，用PH7.2磷酸緩衝液（PBS）充分沖洗，將羊膜置於含0.1萬U/毫升慶大黴素和2.5微克/毫升兩性黴素B的生理鹽水中，浸泡20分鐘；將羊膜儘可能的剪碎，按每克組織加入終濃度2.5克/升胰蛋白酶5毫升，攪拌使之與羊膜充分混和，置入37攝氏度溫箱消化30分鐘後取消化液1000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清液；如此共3次，然後用VDMEM:VF12＝1:1的DMEM/F12培養液5毫升中止胰蛋白酶，以儘可能除去上皮細胞；然後加入終濃度為1.0克/升膠原酶IV和0.1克/升脫氧核糖核酸酶I的VDMEM:VF12＝1:1的DMEM/F12培養液5毫升，置於37攝氏度消化30-60分鐘後得細胞懸液；用200目不鏽鋼網過濾將消化下來的細胞製成單細胞懸液，1000轉/分鐘離心5-10分鐘，用PBS洗2次，用台盼蘭染色，計數活細胞，以2×10升的密度將所得細胞接種於75毫升培養瓶內；在接種時的細胞密度可採用2×10-2×10升。
2、人羊膜間充質幹細胞的無血清培養、純化及擴增
將上述人羊膜間充質細胞接種在75毫升培養瓶培養，內含5毫升無血清培養液，包括：基礎培養基DMEM/F12（按體積1:1混合）：15.0克/升；人血清白蛋白：5.0×10％；人轉鐵蛋白：1.0×10克/升；人胰島素：5.0×10克/升；亞硒酸鈉：5.2×10克/升。
接種時的細胞密度採用2×10升。
置於37攝氏度體積分數為5％的CO2飽和濕度培養箱中培養。培養48-72小時後，更換培養液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，每2-4天全量換液一次；待細胞達到80％-90％融合時，用2.5克/升胰蛋白酶消化，然後按1:2或1:3的比例的比例進行傳代接種培養，並記為P1代。傳代培養過程中每2天全量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重複上述操作進行傳代，此傳代培養記為P2代，然後繼續上述傳代培養過程；傳3代後，細胞生長進入對數生長期，倍增時間為2天。HAMSCs為細長型成纖維狀，融合後呈漩渦狀。隨著傳代的進行，HADMSCs的胞體逐漸增大，出現部分寬大扁平的細胞，失去增殖和分化能力，而大部分細胞仍然維持細長的梭形，保持增生和分化能力；體外培養8代以後，細胞的增殖速度明顯減慢，細胞出現老化現象。
- 實施例3
一種人羊膜間充質幹細胞的分離及無血清培養方法，包括以下步驟：
《一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法》的第1步驟還可以是：胰蛋白酶終濃度為2.5克/升，消化時間為30-60分鐘，次數為2-4次；中止胰蛋白酶的DMEM/F12培養液中人血清白蛋白體積分數可為5.0×10％；膠原酶IV、脫氧核糖核酸酶I消化時，VDMEM:VF12＝1:1的DMEM/F12培養液中膠原酶IV的濃度採用0.5-1.5克/升，脫氧核糖核酸酶0.05-0.15克/升，消化時間為1-2小時；其餘同實施例1。
- 實施例4
一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養方法，包括下述步驟：
1、人羊膜間充質幹細胞的分離及單細胞懸液的製備
將取回的羊膜用PH7.2的PBS（Phosphate buffer saline）磷酸鹽緩衝液反覆沖洗血跡，用大鑷子將絨毛膜層剝離，棄去，羊膜置於抗生素液50毫升中浸泡20分鐘；用PBS沖洗後，用剪刀將其分割成約5×5平方厘米分別置於玻璃平皿中，儘量剪碎，加入終濃度為2.5克/升胰蛋白酶5毫升，37攝氏度溫箱消化30分鐘，轉移至15毫升離心管中，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清液，如此共消化3次。最後一遍時加入等量的DMEM/F12，5毫升，終止消化，離心，棄上清，PBS反覆沖洗，再離心，棄上清；加入終濃度為1.0克/升的膠原酶IV和0.1克/升DNA酶I混合液5毫升，置於37攝氏度溫箱消化1小時，加入等量體積的DMEM/F12培養液5毫升，混勻，終止消化；將細胞篩置於直徑10厘米玻璃平皿上，將上步液體倒入細胞篩上過濾收集細胞，將收集到的液體轉移至15毫升離心管中，1000轉/分鐘離心5分鐘，收集細胞。
將上步收集的液體離心後棄上清，用DMEM/F12培養液5毫升重懸細胞沉澱，以2×10/升接種於25平方厘米培養瓶中。
2、人羊膜間充質幹細胞的無血清培養、純化及擴增
將上述人羊膜間充質細胞接種在25平方厘米培養瓶培養，內含5毫升無血清培養液，其中：基礎培養基為VDMEM:VF12＝1:1的DMEM/F1215.6克/升培養液5毫升，包含體積分數1.0×10％人血清白蛋白、5.5×10克/升人轉鐵蛋白、10×10克/升人胰島素和6.7×10克/升亞硒酸鈉，接種時的細胞密度採用2×10升。
置於37攝氏度體積分數為5％的CO2飽和濕度培養箱中培養，記為P0根據細胞細胞貼壁情況，1-2天用DMEM/F12培養液5毫升全量換液一次；待細胞長至80％-90％融合時，按1:3的比例傳代接種培養，記為P1。以此類推。
- 實施例5
《一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法》採用流式細胞術鑑定羊膜間充質幹細胞如下：
1、收集細胞：待細胞密度達到90％融合時，棄去無血清培養基培養液，用預冷的1×PBS5毫升漂洗兩次，棄淨PBS後加入0.25％的胰酶1毫升，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，當細胞變圓後加入2毫升無血清培養基培養液終止消化，轉移細胞至1.5毫升離心管中800轉/分鐘離心5分鐘，棄上清，用預冷的1×PBS1毫升重懸細胞沉澱，以同樣的條件重複離心一次，棄上清；
2、一抗孵育：用500微升抗體稀釋緩衝液（1×PBS，2％胎牛血清FBS）1:100稀釋一抗CD105、CD44，1:50稀釋一抗CD73，冰上緩搖孵育45分鐘，2000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清；
3、洗滌：用1×PBS1毫升重懸細胞沉澱，2000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清。
4、二抗孵育：用500微升抗體稀釋緩衝液（1×PBS，2％FBS）1:500稀釋二抗異硫氰酸螢光素（FITC）偶聯的驢抗小鼠、FITC偶聯的驢抗山羊，冰上緩搖孵育30分鐘，2000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清；
5、洗滌：用1×PBS1毫升重懸細胞沉澱，2000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清；
6、流式檢測：以1％的多聚甲醛300微升重懸細胞沉澱，將細胞轉移到流式管中，在流式細胞儀中檢測。
- 實施例6
《一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法》採用免疫螢光法鑑定羊膜間充質幹細胞如下：
1、細胞爬片：將處理好的乾淨的蓋片，置入六孔板內，以2×10密度將HAMSCs接種到放入蓋片段六孔板內，置於37攝氏度體積分數為5％的CO2飽和濕度培養箱中培養；
2、固定：待細胞生長70-80％融合時，棄去培養液，用1×PBS洗兩遍，加入4％多聚甲醛溶液，室溫固定20分鐘；
3、洗滌：吸淨多聚甲醛，加入1×PBS，50轉/分鐘洗滌5分鐘，重複三次；
4、封閉：加入封閉液（含1％小牛血清白蛋白（BSA）的PBS中），室溫封閉30分鐘；
5、一抗孵育：用500微升抗體稀釋緩衝液（1×PBS，1％BSA）1:100稀釋一抗CD90、CD44，CD73覆蓋蓋片表面並置入濕盒內，4攝氏度，過夜；
6、洗滌：吸淨多聚甲醛，加入1×PBS1毫升，50轉/分鐘洗滌5分鐘，重複三次；
7、二抗孵育：用500微升抗體稀釋緩衝液（1×PBS，1％BSA）1:500稀釋二抗FITC偶聯的驢抗小鼠、四甲基異硫酸羅丹明（TRITC）偶聯的驢抗山羊，室溫孵育1小時；
8、洗滌：吸淨多聚甲醛，加入1×PBS1毫升，50轉/分鐘洗滌5分鐘，重複三次；
9、核染色：用去離子水（ddH2O）按1:1000的比例稀釋二脒苯基吲哚（DAPI）儲存液，工作液濃度為1微克/毫升，染色1分鐘，使用ddH2O洗三次，每次5分鐘；
10、封片：用95％甘油封片，置於螢光顯微鏡下觀察。
- 實施例7
《一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法》誘導羊膜間充質幹細胞向脂肪、骨、軟骨細胞分化包括：
一. 誘導羊膜間充質幹細胞向脂肪細胞分化
1、將獲得的HAMSCs種入六孔板內用無血清培養基培養，待細胞長得70％融合時更換為誘導培養基即含10％FBS的DMEM培養基3毫升，添加1微摩爾（微摩爾/升）地塞米松、0.5微摩爾/升異丁甲基黃嘌呤、60微摩爾/升茚甲新和170微摩爾/升胰島素；
2、每3天更換誘導培養基1次，3毫升，培養14天；
3、培養終止後，加入2％多聚甲醛室溫固定10分鐘，用60％的異丙醇2毫升洗滌；
4、油紅O室溫孵育10分鐘，置於顯微鏡下觀察。
二. 誘導羊膜間充質幹細胞向成骨細胞分化
1、將獲得的HAMSCs種入六孔板內，待細胞長得70％融合時更換為含10％FBS的DMEM培養基3毫升，添加0.1微摩爾/升地塞米松、50微克/毫升抗壞血酸和10毫摩爾/升甘油磷酸酯；
2、每3天換液1次，3毫升，培養21天；
3、培養終止後，加入4％的多聚甲醛2毫升固定10分鐘，用鹼性磷酸酶染色（BCIP/NBT）室溫孵育2小時，蒸餾水洗一遍，鏡下檢測；
三. 誘導羊膜間充質幹細胞向軟骨細胞分化
1、將獲得的HAMSCs以2×10種入六孔板內，培養液更換為無血清培養基培養液與0.5％的人血清白蛋白培養液。並添加50微克/毫升抗壞血酸，100微克/毫升丙酮酸鈉，0.1微摩爾/升地塞米松和10納克/毫升轉化生長因子-β1（TGF-β1）；
2、隔天換液，TGF-β1每次換液時現加，培養22天；
3、培養終止後，加入4％的多聚甲醛固定10分鐘，艾茜藍（Alcianblue）染色過夜，顯微鏡下觀察。
實例結果
1、羊膜間充質幹細胞的原代培養結果
原代獲得的HAMSCs培養6小時開始貼壁，原代培養後貼壁呈圓形，4-5天后原代獲得的HAMSCs開始伸展為成纖維狀。兩周后原代獲得的HAMSCs呈集落生長（圖1，P0）。將形成的細胞集落用胰酶消化傳代，記為P1（圖1，P1）。傳代後的細胞生長速度逐漸加快，貼壁的HAMSCs呈梭形伸展狀。傳2、3代後，細胞生長進入對數生長期，倍增時間為2天。HAMSCs為細長型成纖維狀，融合後呈漩渦狀（圖1，P3-P5）。
圖1，原代培養的HAMSCs，倒置顯微鏡（×40），從人羊膜原代分離得到人羊膜間充質幹細胞（HAMSCs），是原代獲得的細胞，P1-P5為傳代後的HAMSCs。細胞生長旺盛，呈細長的成纖維狀。
2、羊膜間充質幹細胞流式細胞術鑑定結果
CD44是一種細胞膜表面糖蛋白，屬於細胞黏連分子家族，介導生長過程中細胞與細胞之間的相互作用。CD90也稱為Thy-1，是幹細胞的一種表面標記物。CD105即為SH2，屬於Endoglin一種細胞表面分子。CD44、CD90、CD105分子在骨髓間充質幹細胞中陽性表達，是間質細胞的一種重要的表面標記物。利用流式細胞術鑑定HAMSCs同樣陽性表達CD44、CD90、CD105（圖2-1）。
3、羊膜間充質幹細胞免疫螢光鑑定結果
圖3-1，HAMSCs細胞的CD44免疫螢光染色（×100），體外培養HAMSCs，並經細胞免疫螢光法染色。紅色代表的是CD44，主要在膜上表達。藍色是用DAPI復染的細胞核，在螢光顯微鏡下觀察得到圖像。
圖3-2，HAMSCs細胞的CD73免疫螢光染色（×40），體外培養HAMSCs，並經細胞免疫螢光法染色。綠色代表的是CD73，主要在膜上表達。藍色是用DAPI復染的細胞核，在螢光顯微鏡下觀察得到圖像。
圖3-3，HAMSCs細胞的CD90免疫螢光染色（×100），體外培養HAMSCs，並經細胞免疫螢光法染色。紅色代表的是CD90，主要在膜上表達。藍色是用DAPI復染的細胞核，在螢光顯微鏡下觀察得到圖像。
4、誘導羊膜間充質幹細胞向脂肪、骨、軟骨細胞分化結果
誘導羊膜間充質幹細胞向脂肪細胞分化如圖4-1所示，間充質幹細胞細胞是來源於發育中胚層的細胞，具有向中胚層細胞分化的潛力。體外培養HAMSCs可誘導該細胞向成骨細胞、脂肪和軟骨細胞分化。誘導HAMSCs向脂肪分化可看到細胞內的小液泡，用油紅0染色可將其染成紅色。圖4-1，體外誘導HAMSCs分化為脂肪細胞（×100），將體外培養HAMSCs誘導分化為脂肪細胞，油紅O將脂肪滴染成紅色。
誘導羊膜間充質幹細胞向成骨細胞分化如圖4-2所示，成骨細胞來源於中胚層細胞，成熟的成骨細胞中含有鹼性磷酸酶。圖4-2，體外誘導HAMSCs分化為成骨細胞（×100），將體外培養HAMSCs誘導分化為成骨細胞，檢測誘導後的細胞胞漿內的鹼性磷酸酶染色為藍紫色。誘導羊膜間充質幹細胞向軟骨細胞分化如圖4-3所示，軟骨細胞來源於中胚層細胞，軟骨細胞含有豐富的酸性物質與粘蛋白，可被艾茜藍染成藍色。圖4-3，體外誘導HAMSCs分化為軟骨細胞（×100），將體外培養HAMSCs誘導分化為軟骨細胞，誘導後的細胞艾茜藍染色為藍色，艾茜藍可以將軟骨中的酸性粘蛋白染成藍色。
專利榮譽
2021年6月24日，《一種人羊膜間充質幹細胞無血清培養基及其培養方法》獲得第二十二屆中國專利優秀獎。
