《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》是廣州賽萊拉幹細胞科技股份有限公司於2015年4月21日申請的專利，該專利的公布號為CN104770363A，申請號為201510191390X，授權公布日為2015年7月15日，發明人是王一飛、陳海佳、葛嘯虎、王小燕、萬樺、羅二梅。
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》涉及幹細胞領域，公開了一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法。該發明所述間充質幹細胞的凍存液包括無血清培養基、DMSO、右旋糖酐-40，其中所述DMSO的濃度為3體積比～7體積比，按克/毫升計右旋糖酐-40的濃度為1質量濃度～3質量濃度。該發明間充質幹細胞的凍存液，凍存細胞之後活率顯著提高，並保持良好的幹細胞特性。該發明所述間充質幹細胞的凍存方法採用該發明所述凍存液重懸細胞並調整細胞密度後凍存細胞。該發明所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞復甦後不僅在存活率上有明顯的提高，細胞增殖能力也優於常規的凍存方法，而且間充質幹細胞的特異性表面標記也沒有明顯的下降，均有較高的表達率。
2018年12月20日，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》獲得第二十屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法
- 公告號：CN104770363A
- 授權日：2015年7月15日
- 申請號：201510191390X
- 申請日：2015年4月21日
- 申請人：廣州賽萊拉幹細胞科技股份有限公司
- 地址：廣東省廣州市國際生物島螺旋四路一號生產區第五層502單元
- 發明人：王一飛、陳海佳、葛嘯虎、王小燕、萬樺、羅二梅
- Int.Cl.：A01N1/02(2006.01)I
- 代理機構：北京集佳智慧財產權代理有限公司
- 代理人：趙青朵
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
幹細胞（stem cell）是一類具有自我複製能力（self-renewing）的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化想笑成多種功能細胞。間充質幹細胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是幹細胞家族的重要成員，來源於發育早期的中胚層和外胚層。MSC具有幹細胞的共性，即自我更新、多向分化和歸巢的能力。在特定的機體外分化環境下，能夠誘導分化為神經、心臟、骨、軟骨、脂肪、上皮等多種組織細胞，被認為是細胞治療技術的最有希望的來源細胞之一，是近幾年研究的熱點。MSC作為重要的再生醫學資源，在臨床的疾病治療領域將有非格催連常重要的套用價值。
間充質幹細胞在體外經過連續傳代培養和凍存復甦後仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用於衰老和病變引起的組織器官損傷修復。因此，研究一種有效的細胞凍存方法，使具有臨床套用價值的MSC能在體外長期保存並維持原有的多向分化能力，顯得尤為重要。
MSC的凍存需要將處於對數生長期的細胞收集起來，用含有特定成分的細胞凍存液製成單細胞懸液，分裝於凍存管中後置於超低溫冰櫃或者灑拘主液氮中進行長期凍存。
截至2015年4月21日技術中，細胞凍存液中的主要成分有10％二甲基亞碸（DMSO）、20％～90％胎牛血清（FBS）、剩餘組分為不完全培養基。培養基以及FBS可為細胞提供必要的營養物質。DMSO是一種滲透性保護劑，能夠降低棕嫌元凝細胞冰點，減少冰晶的形成，從而達到降低細胞損傷的保護效果。但FBS屬於動物源性物質，成分比較複雜，在臨床套用上存在潛在的風險，也增加了污染的幾率。而高濃度DMSO在常溫狀態下對細胞具有非常大的毒性作用。
細胞凍存的方法在現有技術中採用最多的是您雄影凝利用凍存盒置於超低溫冰櫃中放置24～72小時，再轉移至液氮中進行長期的保存。但凍存盒在逐漸降溫的過程中無法精確控制降溫速率，會導致凍存液中形成較多的冰晶，導致細胞受到較大的損傷。
發明內容
專利目的
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》目的在於針對現有技術存在的問題，提供一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法。
技術方案
為了實現《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》的目的，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》採用如下技術方案：
一種間充質幹細胞的凍存液包括無血清培養基、DMSO、右旋糖酐-40，其中所述DMSO的濃度為3體積比～7體積比，按克/毫升計右旋糖酐-40的濃度為1質量濃度比～3質量濃度比。
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液中含有非滲透性抗凍劑右旋糖酐40，降低了DMSO的濃度。右旋糖酐40能溶於水，但不能進入細胞，使溶液呈過冷狀態，通過降低溶質損傷從而起到保護作用。
在一些實施方案中，所述的凍存液中所述DMSO的濃度為5體積比，按克/毫升計右旋棵歸射糖酐-40的濃度為1質量濃度比。
在一些實施方案中，所述的凍存液中所述無血清培養基為lonza Ultra CULTUREMEDIUM無血清培養基。
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》還提供了一種間充質幹細胞的凍存方法，取間充質幹細胞細胞懸液離心收集細胞，用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液重懸細胞並調整細胞密度，分裝於凍存管中凍存。
在一些實施方案中，所述的凍存方法中，所述細胞密度為1×106/毫升。
在一些實施方案中，所述的凍存方法中，所述凍存的具體方法為≤-80攝氏度凍存。
在一些優選實施方案中，所述的凍存方法中，所述≤-80攝氏度凍存為-80攝氏度超低溫冰櫃長期凍存或液氮中長期凍存。
在另一些實施方案中，所述的凍存方法中，所述凍存的具體方法為程式降溫儀逐漸降溫至-90攝氏度後轉移至液氮中進行長期保存。程式降溫儀能夠更精確地控制降溫速率，避免冰晶的產生，降低細胞的損傷。
在一些優選實施方案中，所述的凍存方法中，所述程式降溫儀降溫程式為：
4攝氏度，維持分鐘；
-1攝氏度/分直至-4攝氏度；
-25攝氏度/分直至-12攝氏度；
-1攝氏度/分直至-40攝氏度；
-10攝氏度/分直至-90攝氏度；
-90攝氏度，維持分鐘。
《一種間充質幹細胞的凍存液及汽拔厚凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法方法，適用於所有類型MSC的凍存方法，所述間充質幹細胞可以為骨髓間充質幹細胞、脂肪間充質幹細胞、臍帶間充質幹細胞、胎盤間充質幹細胞、牙髓間充質幹細胞或外周血間充質幹細胞。
在一些實施方案中，所述間充質幹細胞的分離培養方法具體為組織塊剪碎，加入完全培養基，於37攝氏度，5％CO2靜止培養，期間補加完全培養基，待組織塊有細胞爬出後去掉組織塊，清洗後加入完全培養基繼續培養，當細胞融合度達到80％～90％後，去掉細胞培養上清，清洗後加入含EDTA的胰蛋白酶消化液消化，完全培養基終止消化，細胞吹打成單細胞懸液。
其中，在一些實施方案中，所述間充質幹細胞的分離培養方法中所述完全培養基的組成成分為：Lonza通用UltraCULTURE無血清培養基+5體積比PALL血清替代物+2毫米/升-谷氨醯胺+100毫克/升NEAA。
在一些實施方案中，所述間充質幹細胞的分離培養方法中所述含EDTA的胰蛋白酶消化液中胰蛋白酶濃度為0.25％（體積分數），EDTA濃度為0.04％（體積分數）。
在一些實施方案中，所述間充質幹細胞的分離培養方法中所述原代分離培養方法中消化液消化的時間為1-2分鐘。
在一些實施方案中，所述間充質幹細胞的分離培養方法中所述間充質幹細胞來源與臍帶組織。所述臍帶可以取自產後棄置的臍帶組織，採用含有雙抗的PBS保存。所述含有雙抗的PBS為含青黴素和鏈黴素的磷酸鹽緩衝液，其中青黴素工作濃度為100U/毫升，鏈黴素工作濃度為0.1m克/毫升。
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的分離培養方法中，在組織塊有細胞爬出後去掉組織塊，並對細胞進行清洗。所述清洗可以採用PBS清洗。
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的分離培養方法中，在清洗後加入完全培養基繼續培養，至細胞融合度達到80％～90％。
在一些實施方案中，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的分離培養方法中，所述終止消化的完全培養基的加入量為消化液體積的5倍～10倍。
在一個具體實施例中，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》分別從細胞存活率、增殖情況以及細胞表面標記進行評價，對比《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液與常規凍存液的凍存效果，結果顯示無論是在細胞的數量上，還是細胞存活率上，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞均優於常規凍存液凍存的細胞。而增殖情況結果顯示《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞相對常規凍存液凍存的細胞，較快進入細胞生長期，且增殖的速度較快。此外細胞表面標記結果顯示採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞在培養3天后在特異性表面標記的表達率上，明顯高於採用常規凍存液凍存的細胞。
在一個具體實施例中，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》分別從細胞存活率、增殖情況以及細胞表面標記進行評價，對比《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法與對照組凍存盒的凍存效果，結果顯示無論是在細胞的數量上，還是細胞存活率上，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞均優於對照組凍存盒凍存的細胞。而增殖情況結果顯示《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞相對對照組凍存盒凍存的細胞，較快進入細胞生長期，且增殖的速度較快。此外細胞表面標記結果顯示採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞在培養3天后在特異性表面標記的表達率上，明顯高於採用對照組凍存盒凍存的細胞。
由此可見，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液，結合《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法進行間充質幹細胞的凍存，將起到更好的凍存效果。復甦後的細胞不僅在存活率上有明顯的提高，細胞增殖能力也優於常規的凍存方法，而且間充質幹細胞的特異性表面標記也沒有明顯的下降，均有較高的表達率。
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》還提供了一種間充質幹細胞的凍存試劑盒，包含《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液。
改善效果
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液包括無血清培養基、DMSO、右旋糖酐-40，其中所述DMSO的濃度為3體積比～7體積比，按克/毫升計右旋糖酐-40的濃度為1質量濃度比～3質量濃度比。與常規細胞凍存液相比《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液避免了動物源性物質在臨床套用上的潛在風險，也降低了細胞污染的幾率，同時降低了DMSO的濃度，減少了DMSO對細胞的毒性作用，具有更高的臨床安全性。實驗表明，與常規細胞凍存液相比，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》間充質幹細胞的凍存液，凍存細胞之後活率顯著提高，並保持良好的幹細胞特性，可以用於間充質幹細胞的長期保存及套用。《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述凍存液重懸細胞並調整細胞密度後凍存細胞。與凍存盒凍存的方法相比，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞復甦後不僅在存活率上有明顯的提高，細胞增殖能力也優於常規的凍存方法，而且間充質幹細胞的特異性表面標記也沒有明顯的下降，均有較高的表達率。
附圖說明
圖1示實施例3《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞以及常規凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線圖，其中-為系列1即《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線，—·—為系列2即為常規凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線；
圖2示實施例3復甦後的間充質幹細胞細胞表面標誌物的表達結果圖，其中圖a-c為《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞，圖d-f為常規凍存液凍存的細胞；圖a為FSC及SSC表達情況圖，圖b為CD34及CD44表達情況圖，圖c為CD45及CD90表達情況圖，圖d為FSC及SSC表達情況圖，圖e為CD34及CD44表達情況圖，圖f為CD45及CD90表達情況圖；
圖3示實施例4《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞以及常規凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線圖，其中-為系列1即《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線，—·—為系列2即為常規凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線；
圖4示實施例4復甦後的間充質幹細胞細胞表面標誌物的表達結果圖，其中圖a-c為《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞結果圖，圖d-f為對照組凍存盒凍存的細胞結果圖；圖a為FSC及SSC表達情況圖，圖b為CD34及CD44表達情況圖，圖c為CD45及CD90表達情況圖，圖d為FSC及SSC表達情況圖，圖e為CD34及CD44表達情況圖，圖f為CD45及CD90表達情況圖。
技術領域
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》涉及幹細胞領域，具體涉及一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法。
權利要求
1.一種間充質幹細胞的凍存液，由無血清培養基、DMSO、右旋糖酐-40組成，其中所述DMSO的濃度為3體積比～7體積比，按克/毫升計右旋糖酐-40的濃度為1質量濃度比～3質量濃度比。
2.根據權利要求1所述的凍存液，所述DMSO的濃度為5體積比，按克/毫升計右旋糖酐-40的濃度為1質量濃度比。
3.根據權利要求1或2所述的凍存液，所述無血清培養基為lonzaUltraCULTUREMEDIUM無血清培養基。
4.一種間充質幹細胞的凍存方法，取間充質幹細胞細胞懸液離心收集細胞，用權利要求1所述間充質幹細胞的凍存液重懸細胞並調整細胞密度，分裝於凍存管中凍存。
5.根據權利要求4所述的凍存方法，所述細胞密度為1×106/毫升。
6.根據權利要求4或5所述的凍存方法，所述凍存的具體方法為≤-80攝氏度凍存。
7.根據權利要求6所述的凍存方法，所述≤-80攝氏度凍存為-80攝氏度超低溫冰櫃長期凍存或液氮中長期凍存。
8.根據權利要求4或5所述的凍存方法，所述凍存的具體方法為程式降溫儀逐漸降溫至-90攝氏度後轉移至液氮中進行長期保存。
9.根據權利要求8所述的凍存方法，所述程式降溫儀降溫程式為：4攝氏度，維持分鐘；-1攝氏度/分直至-4攝氏度；-25攝氏度/分直至-12攝氏度；-1攝氏度/分直至-40攝氏度；-10攝氏度/分直至-90攝氏度；-90攝氏度，維持分鐘。
10.一種間充質幹細胞的凍存試劑盒，包含權利要求1所述間充質幹細胞的凍存液。
實施方式
- 實施例1 臍帶間充質幹細胞的分離培養
1、取牛臍帶組織塊，剪碎，將完全培養基加到組織塊中，吹打均勻後轉移到細胞培養皿中；所述完全培養基的組成成分為：Lonza通用UltraCULTURE無血清培養基+PALL血清替代物+2毫米/升-谷氨醯胺+100毫克/升NEAA；
2、搖晃培養皿使組織塊均勻分布於培養皿中，轉移至5％CO2、37攝氏度細胞培養箱中培養，並定期添觀察細胞生長情況；
3、當細胞爬出後，棄掉舊培養基及組織塊，用PBS清洗培養皿後，加入完全培養基繼續置於細胞培養箱中培養；
4、當細胞融合度達到80％～90％後，棄去舊培養基，用PBS清洗培養皿後，加入含EDTA的胰酶混合液進行消化1～2分鐘，加入完全培養基終止消化後，將細胞吹打成單細胞懸液，獲得臍帶間充質幹細胞，並記為P1代細胞。
5、將獲得的P1代細胞離心收集後，以1:3的比例進行傳代培養，用完全培養基接種到培養皿後，置於5％CO2、37攝氏度培養箱繼續培養。當細胞融合度達到80％～90％後即可進行再次傳代，並記為P2代細胞，以此類推。
- 實施例2 臍帶間充質幹細胞的凍存
1、配製凍存液：按照凍存液各組分的比例提前配製好間充質幹細胞的凍存液，其中含5％DMSO（V/V），1％右旋糖苷-40（質量體積比，克/毫升），其餘組分為UltraCULTURE無血清培養基。將配製好的凍存液放於4攝氏度冰櫃中預冷。
2、取實施例1中獲得的P2代細胞，當細胞融合度達到80％～90％後，棄去舊培養基，用PBS清洗培養皿後，添加含EDTA的胰酶混合液進行消化1～2分鐘，加入完全培養基終止消化後，將細胞吹打成單細胞懸液，獲得P2代臍帶間充質幹細胞。
3、取少量細胞懸液利用細胞計數儀進行細胞計數，其餘懸液1500轉每分離心分鐘收集細胞。根據計數結果，加入步驟1預先配製好的間充質幹細胞凍存液重懸細胞，將細胞密度調整為1×106/毫升。
4、將重懸於凍存液的間充質幹細胞分裝於2毫升無菌凍存管中，每管加入1.5毫升，旋緊蓋子後用醫用膠布封口，用標記筆在凍存管上標記上細胞類型、代數、日期等信息。
5、將凍存管放進程式降溫儀的箱體中，打開程式降溫儀中預設的程式，開始運行程式，待程式運行結束後轉移至液氮中即可。
降溫程式為：
4攝氏度，維持分鐘；
-1攝氏度/分直至-4攝氏度；
-25攝氏度/分直至-12攝氏度；
-1攝氏度/分直至-40攝氏度；
-10攝氏度/分直至-90攝氏度；
-90攝氏度，維持分鐘。
6、將凍存管從程式降溫儀的箱體中取出，立即轉移到液氮中進行長期保存。
- 實施例3 《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞凍存液的效果評價
取實施例2中步驟1～2所獲得的臍帶間充質幹細胞的細胞懸液，採用常規的凍存液即含10％DMSO、20％FBS、70％DMEM/F12，凍存方法與實施例2相同。即除了凍存液的組分不同，其他條件均與實施例2保持一致。
將上述凍存的細胞作為對照組，分別從細胞存活率、增殖情況以及細胞表面標記進行評價，對比《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液與常規凍存液的凍存效果。
1、復甦後細胞的細胞存活率比較
分別復甦實驗組及對照組的兩管細胞，復甦後細胞的存活率結果如表1。
凍存液 | 《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》凍存液① | 《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》凍存液② | 常規凍存液① | 常規凍存液② |
細胞數量 | 1.34×10 | 1.28×10 | 1.29×10 | 1.27×10 |
細胞存活率 | 96.3％ | 95.9％ | 88.4％ | 86.8％ |
表1結果顯示，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的兩管細胞，細胞數量平均值為1.32×106，復甦後細胞存活率為96.1％；而對照組採用常規凍存液凍存的兩管細胞，細胞數量平均值為1.28×106，復甦後細胞存活率為87.6％。由此可見，無論是在細胞的數量上，還是細胞存活率上，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞均優於常規凍存液凍存的細胞。
2、復甦後細胞的增殖情況對比：
繪製《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞以及常規凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線圖，結果如圖1
復甦後細胞7天的生長曲線分為3個階段，第一階段為適應期，細胞增殖較慢；第二階段為生長期，細胞增殖較快，呈對數增長；第三階段為平台期，細胞增殖變慢。由圖1結果可見，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞相對常規凍存液凍存的細胞，較快進入細胞生長期，且增殖的速度較快。
3、復甦後細胞表面標記表達率的結果對比：
臍帶間充質幹細胞的特異性表面標記有CD34-、CD44+、CD45-、CD90+。分別復甦實驗組及對照組的兩管細胞，在培養3天后消化收集後製成單細胞懸液，加入帶有免疫螢光的抗體進行孵育，進行臍帶MSC表面標記物的流式檢測。結果見圖2。加入的特異性抗體分別為CD34（呈陰性表達）、CD45（呈陰性表達）、CD44（呈陽性表達）、CD90（呈陽性表達）。結果見圖2。
由圖2結果可見，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞在培養3天后，流式結果顯示CD34-CD44+表達率為99.2％，CD45-CD90+表達率為97.8％。常規凍存液凍存的細胞在培養3天后，流式結果顯示CD34-CD44+表達率為93.8％，CD45-CD90+表達率為92.6％。表明採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞在培養3天后在特異性表面標記的表達率上，明顯高於採用常規凍存液凍存的細胞。
- 實施例4 《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞凍存方法的效果評價
取實施例2中步驟1～4所獲得的加有臍帶間充質幹細胞懸液的凍存管2管，凍存方法改為使用凍存盒放置於超低溫冰櫃中進行降溫保存24h，再轉移到液氮中進行長期保存。除凍存的降溫方法不同，其他條件均與實施例2保持一致。
將上述凍存的細胞作為實驗對照組，分別從細胞存活率、增殖情況以及細胞表面標記進行評價，對比《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法與常規凍存方法的凍存效果。
1、復甦後細胞的細胞存活率比較
分別復甦實驗組及對照組的兩管細胞，復甦後細胞的存活率結果對比如表2。
凍存方法 | 《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》凍存方法① | 《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》凍存方法② | 對照組① | 對照組② |
細胞數量 | 1.31×10 | 1.37×10 | 1.25×10 | 1.23×10 |
細胞存活率 | 95.5％ | 96.1％ | 91.3％ | 89.5％ |
表2結果顯示，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法，即程式降溫儀凍存的兩管細胞，細胞數量平均值為1.34×106，復甦後細胞存活率為95.5％；而對照組採用凍存盒凍存的兩管細胞，細胞數量平均值為1.24×106，復甦後細胞存活率為89.8％。由此可見，無論是在細胞的數量上，還是細胞存活率上，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞均優於對照組凍存盒凍存的細胞。
2、復甦後細胞的增殖情況對比：
繪製《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞以及對照組凍存盒凍存的細胞復甦後7天的生長曲線圖，結果如圖3。
復甦後細胞7天的生長曲線分為3個階段，第一階段為適應期，細胞增殖較慢；第二階段為生長期，細胞增殖較快，呈對數增長；第三階段為平台期，細胞增殖變慢。由圖3結果可見，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞相對對照組凍存盒凍存的細胞，較快進入細胞生長期，且增殖的速度較快。
3、復甦後細胞表面標記表達率的結果對比：
臍帶間充質幹細胞的特異性表面標記有CD34-、CD44+、CD45-、CD90+。分別復甦實驗組及對照組的兩管細胞，在培養3天后消化收集後製成單細胞懸液，加入帶有免疫螢光的抗體進行孵育，進行臍帶MSC表面標記物的流式檢測。結果見圖4。加入的特異性抗體分別為CD34（呈陰性表達）、CD45（呈陰性表達）、CD44（呈陽性表達）、CD90（呈陽性表達）。
由圖4結果可見，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞在培養3天后流式結果顯示CD34-CD44+表達率為98.3％，CD45-CD90+表達率為98.5％。對照組凍存盒凍存的細胞在培養3天后，流式結果顯示CD34-CD44+表達率為93.6％，CD45-CD90+表達率為91.9％。表明採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞在特異性表面標記的表達率上，明顯高於採用對照組凍存盒凍存的細胞。
榮譽表彰
2018年12月20日，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》獲得第二十屆中國專利優秀獎。
發明內容
專利目的
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》目的在於針對現有技術存在的問題，提供一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法。
技術方案
為了實現《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》的目的，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》採用如下技術方案：
一種間充質幹細胞的凍存液包括無血清培養基、DMSO、右旋糖酐-40，其中所述DMSO的濃度為3體積比～7體積比，按克/毫升計右旋糖酐-40的濃度為1質量濃度比～3質量濃度比。
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液中含有非滲透性抗凍劑右旋糖酐40，降低了DMSO的濃度。右旋糖酐40能溶於水，但不能進入細胞，使溶液呈過冷狀態，通過降低溶質損傷從而起到保護作用。
在一些實施方案中，所述的凍存液中所述DMSO的濃度為5體積比，按克/毫升計右旋糖酐-40的濃度為1質量濃度比。
在一些實施方案中，所述的凍存液中所述無血清培養基為lonza Ultra CULTUREMEDIUM無血清培養基。
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》還提供了一種間充質幹細胞的凍存方法，取間充質幹細胞細胞懸液離心收集細胞，用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液重懸細胞並調整細胞密度，分裝於凍存管中凍存。
在一些實施方案中，所述的凍存方法中，所述細胞密度為1×106/毫升。
在一些實施方案中，所述的凍存方法中，所述凍存的具體方法為≤-80攝氏度凍存。
在一些優選實施方案中，所述的凍存方法中，所述≤-80攝氏度凍存為-80攝氏度超低溫冰櫃長期凍存或液氮中長期凍存。
在另一些實施方案中，所述的凍存方法中，所述凍存的具體方法為程式降溫儀逐漸降溫至-90攝氏度後轉移至液氮中進行長期保存。程式降溫儀能夠更精確地控制降溫速率，避免冰晶的產生，降低細胞的損傷。
在一些優選實施方案中，所述的凍存方法中，所述程式降溫儀降溫程式為：
4攝氏度，維持分鐘；
-1攝氏度/分直至-4攝氏度；
-25攝氏度/分直至-12攝氏度；
-1攝氏度/分直至-40攝氏度；
-10攝氏度/分直至-90攝氏度；
-90攝氏度，維持分鐘。
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法方法，適用於所有類型MSC的凍存方法，所述間充質幹細胞可以為骨髓間充質幹細胞、脂肪間充質幹細胞、臍帶間充質幹細胞、胎盤間充質幹細胞、牙髓間充質幹細胞或外周血間充質幹細胞。
在一些實施方案中，所述間充質幹細胞的分離培養方法具體為組織塊剪碎，加入完全培養基，於37攝氏度，5％CO2靜止培養，期間補加完全培養基，待組織塊有細胞爬出後去掉組織塊，清洗後加入完全培養基繼續培養，當細胞融合度達到80％～90％後，去掉細胞培養上清，清洗後加入含EDTA的胰蛋白酶消化液消化，完全培養基終止消化，細胞吹打成單細胞懸液。
其中，在一些實施方案中，所述間充質幹細胞的分離培養方法中所述完全培養基的組成成分為：Lonza通用UltraCULTURE無血清培養基+5體積比PALL血清替代物+2毫米/升-谷氨醯胺+100毫克/升NEAA。
在一些實施方案中，所述間充質幹細胞的分離培養方法中所述含EDTA的胰蛋白酶消化液中胰蛋白酶濃度為0.25％（體積分數），EDTA濃度為0.04％（體積分數）。
在一些實施方案中，所述間充質幹細胞的分離培養方法中所述原代分離培養方法中消化液消化的時間為1-2分鐘。
在一些實施方案中，所述間充質幹細胞的分離培養方法中所述間充質幹細胞來源與臍帶組織。所述臍帶可以取自產後棄置的臍帶組織，採用含有雙抗的PBS保存。所述含有雙抗的PBS為含青黴素和鏈黴素的磷酸鹽緩衝液，其中青黴素工作濃度為100U/毫升，鏈黴素工作濃度為0.1m克/毫升。
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的分離培養方法中，在組織塊有細胞爬出後去掉組織塊，並對細胞進行清洗。所述清洗可以採用PBS清洗。
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的分離培養方法中，在清洗後加入完全培養基繼續培養，至細胞融合度達到80％～90％。
在一些實施方案中，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的分離培養方法中，所述終止消化的完全培養基的加入量為消化液體積的5倍～10倍。
在一個具體實施例中，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》分別從細胞存活率、增殖情況以及細胞表面標記進行評價，對比《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液與常規凍存液的凍存效果，結果顯示無論是在細胞的數量上，還是細胞存活率上，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞均優於常規凍存液凍存的細胞。而增殖情況結果顯示《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞相對常規凍存液凍存的細胞，較快進入細胞生長期，且增殖的速度較快。此外細胞表面標記結果顯示採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞在培養3天后在特異性表面標記的表達率上，明顯高於採用常規凍存液凍存的細胞。
在一個具體實施例中，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》分別從細胞存活率、增殖情況以及細胞表面標記進行評價，對比《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法與對照組凍存盒的凍存效果，結果顯示無論是在細胞的數量上，還是細胞存活率上，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞均優於對照組凍存盒凍存的細胞。而增殖情況結果顯示《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞相對對照組凍存盒凍存的細胞，較快進入細胞生長期，且增殖的速度較快。此外細胞表面標記結果顯示採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞在培養3天后在特異性表面標記的表達率上，明顯高於採用對照組凍存盒凍存的細胞。
由此可見，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液，結合《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法進行間充質幹細胞的凍存，將起到更好的凍存效果。復甦後的細胞不僅在存活率上有明顯的提高，細胞增殖能力也優於常規的凍存方法，而且間充質幹細胞的特異性表面標記也沒有明顯的下降，均有較高的表達率。
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》還提供了一種間充質幹細胞的凍存試劑盒，包含《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液。
改善效果
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液包括無血清培養基、DMSO、右旋糖酐-40，其中所述DMSO的濃度為3體積比～7體積比，按克/毫升計右旋糖酐-40的濃度為1質量濃度比～3質量濃度比。與常規細胞凍存液相比《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液避免了動物源性物質在臨床套用上的潛在風險，也降低了細胞污染的幾率，同時降低了DMSO的濃度，減少了DMSO對細胞的毒性作用，具有更高的臨床安全性。實驗表明，與常規細胞凍存液相比，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》間充質幹細胞的凍存液，凍存細胞之後活率顯著提高，並保持良好的幹細胞特性，可以用於間充質幹細胞的長期保存及套用。《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述凍存液重懸細胞並調整細胞密度後凍存細胞。與凍存盒凍存的方法相比，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞復甦後不僅在存活率上有明顯的提高，細胞增殖能力也優於常規的凍存方法，而且間充質幹細胞的特異性表面標記也沒有明顯的下降，均有較高的表達率。
附圖說明
圖1示實施例3《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞以及常規凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線圖，其中-為系列1即《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線，—·—為系列2即為常規凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線；
圖2示實施例3復甦後的間充質幹細胞細胞表面標誌物的表達結果圖，其中圖a-c為《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞，圖d-f為常規凍存液凍存的細胞；圖a為FSC及SSC表達情況圖，圖b為CD34及CD44表達情況圖，圖c為CD45及CD90表達情況圖，圖d為FSC及SSC表達情況圖，圖e為CD34及CD44表達情況圖，圖f為CD45及CD90表達情況圖；
圖3示實施例4《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞以及常規凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線圖，其中-為系列1即《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線，—·—為系列2即為常規凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線；
圖4示實施例4復甦後的間充質幹細胞細胞表面標誌物的表達結果圖，其中圖a-c為《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞結果圖，圖d-f為對照組凍存盒凍存的細胞結果圖；圖a為FSC及SSC表達情況圖，圖b為CD34及CD44表達情況圖，圖c為CD45及CD90表達情況圖，圖d為FSC及SSC表達情況圖，圖e為CD34及CD44表達情況圖，圖f為CD45及CD90表達情況圖。
技術領域
《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》涉及幹細胞領域，具體涉及一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法。
權利要求
1.一種間充質幹細胞的凍存液，由無血清培養基、DMSO、右旋糖酐-40組成，其中所述DMSO的濃度為3體積比～7體積比，按克/毫升計右旋糖酐-40的濃度為1質量濃度比～3質量濃度比。
2.根據權利要求1所述的凍存液，所述DMSO的濃度為5體積比，按克/毫升計右旋糖酐-40的濃度為1質量濃度比。
3.根據權利要求1或2所述的凍存液，所述無血清培養基為lonzaUltraCULTUREMEDIUM無血清培養基。
4.一種間充質幹細胞的凍存方法，取間充質幹細胞細胞懸液離心收集細胞，用權利要求1所述間充質幹細胞的凍存液重懸細胞並調整細胞密度，分裝於凍存管中凍存。
5.根據權利要求4所述的凍存方法，所述細胞密度為1×106/毫升。
6.根據權利要求4或5所述的凍存方法，所述凍存的具體方法為≤-80攝氏度凍存。
7.根據權利要求6所述的凍存方法，所述≤-80攝氏度凍存為-80攝氏度超低溫冰櫃長期凍存或液氮中長期凍存。
8.根據權利要求4或5所述的凍存方法，所述凍存的具體方法為程式降溫儀逐漸降溫至-90攝氏度後轉移至液氮中進行長期保存。
9.根據權利要求8所述的凍存方法，所述程式降溫儀降溫程式為：4攝氏度，維持分鐘；-1攝氏度/分直至-4攝氏度；-25攝氏度/分直至-12攝氏度；-1攝氏度/分直至-40攝氏度；-10攝氏度/分直至-90攝氏度；-90攝氏度，維持分鐘。
10.一種間充質幹細胞的凍存試劑盒，包含權利要求1所述間充質幹細胞的凍存液。
實施方式
- 實施例1 臍帶間充質幹細胞的分離培養
1、取牛臍帶組織塊，剪碎，將完全培養基加到組織塊中，吹打均勻後轉移到細胞培養皿中；所述完全培養基的組成成分為：Lonza通用UltraCULTURE無血清培養基+PALL血清替代物+2毫米/升-谷氨醯胺+100毫克/升NEAA；
2、搖晃培養皿使組織塊均勻分布於培養皿中，轉移至5％CO2、37攝氏度細胞培養箱中培養，並定期添觀察細胞生長情況；
3、當細胞爬出後，棄掉舊培養基及組織塊，用PBS清洗培養皿後，加入完全培養基繼續置於細胞培養箱中培養；
4、當細胞融合度達到80％～90％後，棄去舊培養基，用PBS清洗培養皿後，加入含EDTA的胰酶混合液進行消化1～2分鐘，加入完全培養基終止消化後，將細胞吹打成單細胞懸液，獲得臍帶間充質幹細胞，並記為P1代細胞。
5、將獲得的P1代細胞離心收集後，以1:3的比例進行傳代培養，用完全培養基接種到培養皿後，置於5％CO2、37攝氏度培養箱繼續培養。當細胞融合度達到80％～90％後即可進行再次傳代，並記為P2代細胞，以此類推。
- 實施例2 臍帶間充質幹細胞的凍存
1、配製凍存液：按照凍存液各組分的比例提前配製好間充質幹細胞的凍存液，其中含5％DMSO（V/V），1％右旋糖苷-40（質量體積比，克/毫升），其餘組分為UltraCULTURE無血清培養基。將配製好的凍存液放於4攝氏度冰櫃中預冷。
2、取實施例1中獲得的P2代細胞，當細胞融合度達到80％～90％後，棄去舊培養基，用PBS清洗培養皿後，添加含EDTA的胰酶混合液進行消化1～2分鐘，加入完全培養基終止消化後，將細胞吹打成單細胞懸液，獲得P2代臍帶間充質幹細胞。
3、取少量細胞懸液利用細胞計數儀進行細胞計數，其餘懸液1500轉每分離心分鐘收集細胞。根據計數結果，加入步驟1預先配製好的間充質幹細胞凍存液重懸細胞，將細胞密度調整為1×106/毫升。
4、將重懸於凍存液的間充質幹細胞分裝於2毫升無菌凍存管中，每管加入1.5毫升，旋緊蓋子後用醫用膠布封口，用標記筆在凍存管上標記上細胞類型、代數、日期等信息。
5、將凍存管放進程式降溫儀的箱體中，打開程式降溫儀中預設的程式，開始運行程式，待程式運行結束後轉移至液氮中即可。
降溫程式為：
4攝氏度，維持分鐘；
-1攝氏度/分直至-4攝氏度；
-25攝氏度/分直至-12攝氏度；
-1攝氏度/分直至-40攝氏度；
-10攝氏度/分直至-90攝氏度；
-90攝氏度，維持分鐘。
6、將凍存管從程式降溫儀的箱體中取出，立即轉移到液氮中進行長期保存。
- 實施例3 《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞凍存液的效果評價
取實施例2中步驟1～2所獲得的臍帶間充質幹細胞的細胞懸液，採用常規的凍存液即含10％DMSO、20％FBS、70％DMEM/F12，凍存方法與實施例2相同。即除了凍存液的組分不同，其他條件均與實施例2保持一致。
將上述凍存的細胞作為對照組，分別從細胞存活率、增殖情況以及細胞表面標記進行評價，對比《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液與常規凍存液的凍存效果。
1、復甦後細胞的細胞存活率比較
分別復甦實驗組及對照組的兩管細胞，復甦後細胞的存活率結果如表1。
凍存液 | 《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》凍存液① | 《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》凍存液② | 常規凍存液① | 常規凍存液② |
細胞數量 | 1.34×10 | 1.28×10 | 1.29×10 | 1.27×10 |
細胞存活率 | 96.3％ | 95.9％ | 88.4％ | 86.8％ |
表1結果顯示，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的兩管細胞，細胞數量平均值為1.32×106，復甦後細胞存活率為96.1％；而對照組採用常規凍存液凍存的兩管細胞，細胞數量平均值為1.28×106，復甦後細胞存活率為87.6％。由此可見，無論是在細胞的數量上，還是細胞存活率上，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞均優於常規凍存液凍存的細胞。
2、復甦後細胞的增殖情況對比：
繪製《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞以及常規凍存液凍存的細胞復甦後7天生長曲線圖，結果如圖1
復甦後細胞7天的生長曲線分為3個階段，第一階段為適應期，細胞增殖較慢；第二階段為生長期，細胞增殖較快，呈對數增長；第三階段為平台期，細胞增殖變慢。由圖1結果可見，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞相對常規凍存液凍存的細胞，較快進入細胞生長期，且增殖的速度較快。
3、復甦後細胞表面標記表達率的結果對比：
臍帶間充質幹細胞的特異性表面標記有CD34-、CD44+、CD45-、CD90+。分別復甦實驗組及對照組的兩管細胞，在培養3天后消化收集後製成單細胞懸液，加入帶有免疫螢光的抗體進行孵育，進行臍帶MSC表面標記物的流式檢測。結果見圖2。加入的特異性抗體分別為CD34（呈陰性表達）、CD45（呈陰性表達）、CD44（呈陽性表達）、CD90（呈陽性表達）。結果見圖2。
由圖2結果可見，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞在培養3天后，流式結果顯示CD34-CD44+表達率為99.2％，CD45-CD90+表達率為97.8％。常規凍存液凍存的細胞在培養3天后，流式結果顯示CD34-CD44+表達率為93.8％，CD45-CD90+表達率為92.6％。表明採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存液凍存的細胞在培養3天后在特異性表面標記的表達率上，明顯高於採用常規凍存液凍存的細胞。
- 實施例4 《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞凍存方法的效果評價
取實施例2中步驟1～4所獲得的加有臍帶間充質幹細胞懸液的凍存管2管，凍存方法改為使用凍存盒放置於超低溫冰櫃中進行降溫保存24h，再轉移到液氮中進行長期保存。除凍存的降溫方法不同，其他條件均與實施例2保持一致。
將上述凍存的細胞作為實驗對照組，分別從細胞存活率、增殖情況以及細胞表面標記進行評價，對比《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法與常規凍存方法的凍存效果。
1、復甦後細胞的細胞存活率比較
分別復甦實驗組及對照組的兩管細胞，復甦後細胞的存活率結果對比如表2。
凍存方法 | 《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》凍存方法① | 《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》凍存方法② | 對照組① | 對照組② |
細胞數量 | 1.31×10 | 1.37×10 | 1.25×10 | 1.23×10 |
細胞存活率 | 95.5％ | 96.1％ | 91.3％ | 89.5％ |
表2結果顯示，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法，即程式降溫儀凍存的兩管細胞，細胞數量平均值為1.34×106，復甦後細胞存活率為95.5％；而對照組採用凍存盒凍存的兩管細胞，細胞數量平均值為1.24×106，復甦後細胞存活率為89.8％。由此可見，無論是在細胞的數量上，還是細胞存活率上，採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞均優於對照組凍存盒凍存的細胞。
2、復甦後細胞的增殖情況對比：
繪製《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞以及對照組凍存盒凍存的細胞復甦後7天的生長曲線圖，結果如圖3。
復甦後細胞7天的生長曲線分為3個階段，第一階段為適應期，細胞增殖較慢；第二階段為生長期，細胞增殖較快，呈對數增長；第三階段為平台期，細胞增殖變慢。由圖3結果可見，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞相對對照組凍存盒凍存的細胞，較快進入細胞生長期，且增殖的速度較快。
3、復甦後細胞表面標記表達率的結果對比：
臍帶間充質幹細胞的特異性表面標記有CD34-、CD44+、CD45-、CD90+。分別復甦實驗組及對照組的兩管細胞，在培養3天后消化收集後製成單細胞懸液，加入帶有免疫螢光的抗體進行孵育，進行臍帶MSC表面標記物的流式檢測。結果見圖4。加入的特異性抗體分別為CD34（呈陰性表達）、CD45（呈陰性表達）、CD44（呈陽性表達）、CD90（呈陽性表達）。
由圖4結果可見，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞在培養3天后流式結果顯示CD34-CD44+表達率為98.3％，CD45-CD90+表達率為98.5％。對照組凍存盒凍存的細胞在培養3天后，流式結果顯示CD34-CD44+表達率為93.6％，CD45-CD90+表達率為91.9％。表明採用《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》所述間充質幹細胞的凍存方法凍存的細胞在特異性表面標記的表達率上，明顯高於採用對照組凍存盒凍存的細胞。
榮譽表彰
2018年12月20日，《一種間充質幹細胞的凍存液及凍存方法》獲得第二十屆中國專利優秀獎。
