《一株紅細菌菌株及其套用》是湖南省植物保護研究所於2009年11月19日申請的發明專利，該專利申請號為2009100447743，公布號為CN101724585A，專利公布日為2010年6月9日，發明人是劉勇、張松柏、張德詠、羅香文、成飛雪、羅源華、程菊娥、何明遠、譚新球、戴建平、朱春暉、楊春曉、劉紹文。
《一株紅細菌菌株及其套用》提供一種紅細菌菌株及其套用，該紅細菌菌株為保藏於中國典型培養物保藏中心、且保藏號為CCTCC No:M 209239的菌株。用該發明的紅細菌菌株可以製備擬除蟲菊酯類農藥降解菌劑，該發明的紅細菌菌株具有生產成本低，農藥去除效果好，高效、無毒、環保等優點，該菌株可通過簡單、快捷、低成本的操作方法製備得到擬除蟲菊酯類農藥降解菌劑。
2017年12月11日，《一株紅細菌菌株及其套用》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一株紅細菌菌株及其套用
- 公布號：CN101724585A
- 公布日：2010年6月9日
- 申請號：2009100447743
- 申請日：2009年11月19日
- 申請人：湖南省植物保護研究所
- 地址：湖南省長沙市芙蓉區馬坡嶺
- 發明人：劉勇、張松柏、張德詠、羅香文、成飛雪、羅源華、程菊娥、何明遠、譚新球、戴建平、朱春暉、楊春曉、劉紹文
- 代理機構：湖南兆弘專利事務所
- 代理人：楊斌
- Int.Cl.：C12N1/20(2006.01)I、A62D3/02(2007.01)I、A62D101/28(2007.01)N、A62D101/04(2007.01)N
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
化學殺蟲劑的使用為農業生產挽回了因蟲害原因造成的損失，促進了現代農業生產的發展。但是，化學殺蟲劑在殺死害蟲的同時，也殺死了有益生物，並殘留在生態系統中，對生態系統造成了嚴重的危害。化學殺蟲劑的大量使用，還容易導致農產品中農藥殘留的超標，嚴重影響農產品的品質，並對人們的身體健康帶來嚴重威脅，對農產品的出口產生消極影響。
菊酯類殺蟲劑是一類人工合成的、類似天然除蟲菊酯的化合物。從20世紀80年代以後，在中國被廣泛用於糧食、蔬菜和果樹等多種作物。農業部的調查統計表明，截至2009年11月，該類農藥是中國出口蔬菜、水果中主要的三類農藥殘留之一。歐盟2007/12/EC農藥殘留標準達到227項，其中規定菊酯類農藥的檢出限量為0.05毫克/千克，標準提高了上百倍，致使中國茶葉對歐盟出口量下降一半。日本2006年出台“肯定列表制度”，其中規定菊酯類農藥的檢出限量為2毫克/千克，使中國茶葉對日出口下降50％左右。嚴重的影響了中國農產品的出口創匯以及國際競爭力。而且，隨著人們生活水平的提高以及環境保護意識的增強，全社會對農藥殘留帶來的環境問題愈來愈關注，人們迫切需要無農藥殘留污染的綠色食品。但是，從目前中國的農業生產現狀以及人口狀況來看，以停止農藥的使用為代價生產無農藥殘留的綠色農產品是行不通的，農藥作為控制病蟲草的有效手段還將繼續在農業生產中發揮不可替代的作用。如何解決農業生產中的這個兩難問題成為各個學科的研究熱點。
實驗室和田間實際套用都表明，微生物修復為理論基礎的農藥殘留降解菌技術為降低農產品和農業生產環境中的農藥殘留物提供了可行的途徑，該技術具有高效、無毒、無二次污染的特點，而且經濟實用，操作簡便，成為去除農藥殘留污染的一種重要方法。然而，要在大量微生物中篩選、分離出高效降解農藥的菌株，製備出使用方便的菌劑，並進行合理化地套用，也是該領域技術人員需要面臨的技術難題。
發明內容
專利目的
《一株紅細菌菌株及其套用》要解決的技術問題是克服2009年11月之前已有技術的不足，提供一種生產成本低、農藥去除效果、高效、無毒、環保的微生物菌株，相應地，還提供一種微生物菌株的套用，使其能以低成本、方便快捷的操作實現對擬除蟲菊酯類農藥的有效降解。
技術方案
《一株紅細菌菌株及其套用》提出的技術方案為一種紅細菌（Rhodobactersp.）菌株，其特徵在於：所述菌株為保藏於中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC）、且保藏號為CCTCC M 209239的菌株。該菌株的保藏單位為中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏單位地址位於中國武漢武漢大學，保藏日期為2009年10月23日，該菌株被命名為紅細菌S2—1（Rhodobactersp.S2—1）。
上述《一株紅細菌菌株及其套用》的紅細菌菌株是通過以下方法篩選得到：將采自某農藥廠的污泥2.0克加入120毫升PSB液體培養基中，光照培養7天后，取1％接種到含甲氰菊酯100毫克/升PSB液體培養基中，30±2℃，約3000勒克斯，光照培養7天后，取300微升菌液稀釋塗布到含甲氰菊酯100毫克/升 PSB固體培養基中，光照培養至菌落出現，挑取菌落形態不同的菌，分別接種到含甲氰菊酯100毫克/升選擇性液體培養基中，30±2℃、約3000勒克斯，光照培養7天后，取1％分別接種到200毫克/升PSB液體培養基中，重複以上步驟，直到1000毫克/升PSB液體培養基中。15天后檢測農藥濃度，以含相同濃度的甲氰菊酯，相同培養條件不接種細菌的培養基為對照。選擇降解率最大的紅細菌菌株（命名為Rhodobactersp.S2—1）進行後續研究。將該菌株接種於120毫升PSB培養基中培養，30±2℃、約3000勒克斯，光照培養，梯度稀釋平板培養法測定菌株生物量，後續實驗中菌液濃度調整至約10cfu/毫升。
上述技術方案中，所述紅細菌CCTCC M 209239，優選為具有以下主要特徵的菌株：
G—，個體形態為桿狀，V—P反應陰性，甲基紅反應陰性，不能利用澱粉，硫化氫反應陰性，3％氯化鈉中不能生長，最適生長溫度為30℃～35℃，最適生長pH值為6.5～7.5，菌體的特徵吸收峰為525納米、805納米和865納米，16Sr DNA序列長度為1416bp，在Genbank中的登錄號為GQ429219。
滿足上述特徵描述的紅細菌CCTCC M 209239在下述套用中的效果更好。
《一株紅細菌菌株及其套用》還提供一種上述紅細菌CCTCC M 209239在降解擬除蟲菊酯類農藥中的套用。
上述的套用優選是指用所述紅細菌CCTCC M 209239製備擬除蟲菊酯類農藥降解菌劑，其具體的製備方法優選包括以下步驟：
a.將所述紅細菌CCTCC M 209239的超低溫保存種按平板培養法進行培養，培養至紅色菌落出現；
b.將所述紅色菌落中的單菌落接入血清瓶，用紅細菌菌株種子培養基培養至對數生長期；
c.將步驟b培養後得到的菌液按不少於紅細菌菌株生產培養基總體積1％的接種量（優選1％～5％）接種到生產瓶（例如5L的生產瓶，該瓶可以為透明玻璃瓶）中，用紅細菌菌株生產培養基培養至對數生長期；
d.出瓶分裝製得擬除蟲菊酯類農藥降解菌劑。
上述紅細菌菌株CCTCC M 209239的套用中，所述平板培養法優選是採用雙層PSB固體培養基進行培養，所述雙層PSB固體培養基的主要成分包括（NH4）2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl0.02％、酵母膏0.15％和瓊脂1.5％。
上述紅細菌菌株CCTCC M 209239的套用中，所述紅細菌菌株種子培養基、紅細菌菌株生產培養基均優選為PSB液體培養基，所述PSB液體培養基的主要成分包括：（NH4）2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl0.02％和酵母膏0.15％。
上述套用中的製備方法是通過不斷最佳化培養條件而得出的最優培養方案，利用該方法培養《一株紅細菌菌株及其套用》紅細菌菌株，具有以下兩個優勢：一是菌株生長速度快，二是價格低廉，三是培養方法簡單、易於操作。
上述套用中的製備方法的全流程時間一般為25天左右，培養結束後，菌體數量可達到10億個/毫升以上，培養完成後出瓶可直接用塑膠包分裝成液體菌劑。
上述紅細菌CCTCC M 209239的套用中，所述步驟a、步驟b、步驟c的每一次培養過程中，優選的pH值均為7.0～7.2，優選的培養溫度均為30℃～35℃，優選的光照條件均為2000勒克斯～3000勒克斯。前述最佳化後的工藝參數能使《一株紅細菌菌株及其套用》的紅細菌菌株生長更迅速，從而縮短生產時間。
改善效果
與2009年11月之前的技術相比，《一株紅細菌菌株及其套用》的優點在於：該發明提供了一種生產成本低、農藥去除效果好、高效、無毒、環保的紅細菌CCTCC M 209239，該菌株可通過簡單、快捷、低成本的操作方法製備得到擬除蟲菊酯類農藥降解菌劑，使用該發明菌株製備得到的降解菌劑具有生產成本低、使用方便，去除效果好等優點，能夠有效用於農業生產中無農藥殘留糧食、水果、蔬菜等的生產。實驗表明，該發明的菌株不僅可用於實驗室條件下培養基中高濃度擬除蟲菊酯類農藥（例如甲氰菊酯）的降解，還可用於田間農作物上擬除蟲菊酯類殘留農藥的降解和去除（例如去除白菜上的氯氰菊酯殘留）。該發明的套用可以在對農作物正常施用化學農藥、消滅蟲害進而保證作物產量的前提下，又能使糧食、水果、蔬菜等農作物中的農藥殘留降至很低或沒有。而且，該發明的菌株本身具有多種營養成分及活性物質，能夠有效促進作物生長，兼具防治作物病害的作用，具有安全、無毒、環保的特點。此外，由於該發明的菌株可以套用於降解高濃度擬除蟲菊酯類農藥，因此亦可用於農藥生產廢水的處理。
技術領域
《一株紅細菌菌株及其套用》涉及一種細菌及其套用，尤其涉及一種細菌菌株及其在降解農藥殘留中的套用。
權利要求
1.一種紅細菌菌株，其特徵在於：所述紅細菌（Rhodobactersp.）菌株為保藏於中國典型培養物保藏中心、且保藏號為CCTCC M 209239的菌株。
2.根據權利要求1所述的紅細菌菌株，其特徵在於，所述菌株為具有以下主要特徵的菌株：G—，個體形態為桿狀，V—P反應陰性，甲基紅反應陰性，不能利用澱粉，硫化氫反應陰性，3％氯化鈉中不能生長，最適生長溫度為30℃～35℃，最適生長pH值為6.5～7.5，菌體的特徵吸收峰為525納米、805納米和865納米，16SrDNA序列長度為1416鹼基對，在Genbank中的登錄號為GQ429219。
3.一種如權利要求1或2所述紅細菌菌株在降解擬除蟲菊酯類農藥中的套用。
4.根據權利要求3所述的套用，其特徵在於，用所述紅細菌菌株製備擬除蟲菊酯類農藥降解菌劑，其具體的製備方法包括以下步驟：
a.將所述紅細菌菌株的保存種按平板培養法進行培養，培養至紅色菌落出現；
b.將所述紅色菌落中的單菌落接入血清瓶，用紅細菌菌株種子培養基培養至對數生長期；
c.將步驟b培養後得到的菌液按不少於紅細菌菌株生產培養基總體積1％的接種量接種到生產瓶中，用紅細菌菌株生產培養基培養至對數生長期；
d.出瓶分裝製得擬除蟲菊酯類農藥降解菌劑。
5.根據權利要求4所述的套用，其特徵在於：所述平板培養法是採用雙層PSB固體培養基進行培養，所述雙層PSB固體培養基的主要成分包括（NH4）2SO4O.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl0.02％、酵母膏0.15％和瓊脂1.5％。
6.根據權利要求4所述的套用，其特徵在於：所述紅細菌菌株種子培養基、紅細菌菌株生產培養基均為PSB液體培養基，所述PSB液體培養基的主要成分包括：（NH4）2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl0.02％和酵母膏0.15％。
7.根據權利要求4、5或6所述的套用，其特徵在於：所述步驟a、步驟b、步驟c的每一次培養過程中，pH值均控制為7.0～7.2，培養溫度均控制為30℃～35℃，光照條件均控制為2000勒克斯～3000勒克斯。
8.根據權利要求4、5或6所述的套用，其特徵在於：所述步驟c中菌液的接種量為紅細菌菌株生產培養基的1％～5％。
實施方式
實施例1
一種《一株紅細菌菌株及其套用》的紅細菌菌株，該菌株保藏於中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏號為CCTCC M 209239。該菌株具有以下主要特徵：
G—，個體形態為桿狀，V—P反應陰性，甲基紅反應陰性，不能利用澱粉，H2S反應陰性，3％NaCl中不能生長，最適生長溫度為30℃～35℃，最適生長pH值為6.5～7.5，菌體的特徵吸收峰為525納米、805納米和865納米，16SrDNA序列長度為1416bp，在Genbank中的登錄號為GQ429219。
實施例1例用上述紅細菌CCTCC M 209239製備擬除蟲菊酯類農藥降解菌劑，其方法具體包括以下步驟：
（1）活化：將上述紅細菌CCTCC M 209239的超低溫保存種按雙層平板培養法進行培養，該雙層平板培養法具體是用雙層PSB固體培養基進行培養，其主要成分包括（NH4）2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl0.02％、酵母膏0.15％和瓊脂1.5％，培養時的pH值為7.0～7.2，溫度為30℃～35℃，光照條件為2000勒克斯～3000勒克斯，培養至紅色菌落出現；
（2）種子培養：將步驟（1）培養出的紅色菌落中的單菌落接入血清瓶，用PSB液體培養基培養，該PSB液體培養基的主要成分包括：（NH4）2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl0.02％和酵母膏0.15％，培養時的pH值為7.0～7.2，溫度為30℃～35℃，光照條件為2000勒克斯～3000勒克斯，培養至對數生長期；
（3）生產培養：將步驟（2）培養後得到的菌液按紅細菌菌株生產培養基總體積的1％～5％的接種量接種到生產瓶中，用紅細菌菌株生產培養基培養，該生產培養基的主要成分包括：（NH4）2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl0.02％和酵母膏0.15％，培養時的pH值為7.0～7.2，溫度為30℃～35℃，光照條件為2000勒克斯～3000勒克斯，培養至對數生長期；
（4）出瓶分裝製得擬除蟲菊酯類農藥降解菌劑。
本實施例方法的全流程培養時間為25天，培養結束後，菌體數量達到10億個/毫升以上。
實施例2
《一株紅細菌菌株及其套用》菌株在降解培養基中高濃度甲氰菊酯的套用
甲氰菊酯用丙酮溶解，添加到實驗培養基中至甲氰菊酯的終濃度為600毫克/升，所用的實驗培養基為：（NH4）2SO40.1％、MgSO40.02％、NaHCO30.5％、K2HPO40.05％、NaCl0.02％和酵母膏0.15％，該實驗培養基的pH值為7.0～7.2，溫度為30℃～35℃，光照強度為2000勒克斯～3000勒克斯，將實施例1中製備的菌劑接種到該實驗培養基中培養15天。用石油醚萃取培養後實驗培養基中的甲氰菊酯，氣相色譜儀（Agilent 6890N）測定甲氰菊酯殘留，檢測器為電子俘獲器（ECD）。以不加菌劑的實驗培養基為對照。所有處理重複三次，測定結果見下表1所示。
農藥品種 | 甲氰菊酯 | |
處理方式 | 對照處理(未處理) | 《一株紅細菌菌株及其套用》菌劑 |
農藥濃度 (毫克/升) | 586.51 | 367.50 |
降解率(%) | 37.34 | |
由上表1可見，套用《一株紅細菌菌株及其套用》的菌株，15天可以使600毫克/升甲氰菊酯的降解率達到37.34％。
實施例3
《一株紅細菌菌株及其套用》菌株在降解田間白菜和土壤中氯氰菊酯的套用
選用4.5％高效氯氰菊酯乳油（南京紅太陽集團股份有限公司生產）作為藥劑，推薦使用劑量上限的1.5倍，按每畝噴施60千克水量計算噴霧，藥劑處理小區面積為32.25平方米，對照處理小區面積為80.75平方米，根據登記時推薦的採收間隔期（14天）和兩次施藥的間隔期（10天），確定施藥三次。第一次施藥時間為8月31日，第二次為9月10日，第三次為9月20日。
取實施例1製備的菌劑200毫升，兌水60千克後均勻噴施在大白菜（夏陽白）上。第一次噴施菌劑時間為8月31日，第二次為9月10日，第三次為9月20日（均在藥劑噴施以後噴施菌劑）。以噴施菌劑的田間白菜作為對照。所有處理重複三次。
10月6日採樣。
植株樣品：小區對角線法四點取樣，每處理小區每點採樣1株，有病、過大、過小的植株均不採，每處理小區共4株，去掉爛葉和黃葉。先將每株白菜縱切為四份，取相對的兩份再切成長約2厘米的碎片，4株全部切完後充分拌勻，若超過1千克則再用四分法取相對的兩份合成一個約1千克重的植株樣品。取樣、切樣和裝樣的整個過程操作人員均戴一次性塑膠手套，裝樣品的其他器具均墊上塑膠薄膜，每個處理取樣完成後更換手套和塑膠薄膜。
土壤樣品：小區對角線法四點取樣，每處理小區採集0～10厘米耕層土樣1千克左右；對照樣品在每個處理小區的無菜空白區上，對角線法四點取樣，採集0～10厘米耕層土樣1千克左右混合為一個樣品。取樣操作人員戴一次性塑膠手套，每個處理取樣完成後更換一次性塑膠手套以及取樣器。
所有樣品於同年11月4日全部送湖南省農產品質量檢測檢驗中心檢測。檢測結果見下表2。
項目/對象 | 檢測值 (毫克/千克) | 降解率(%) | 降解效果 |
《一株紅細菌菌株及其套用》套用於白菜 | 0.0512 | 62.07 | 低於限量 |
對照 | 0.135 | ||
《一株紅細菌菌株及其套用》套用於土壤 | 0.0181 | 51.86 | 低於限量 |
對照 | 0.0376 |
由上表2可知，在田間實際套用中，可以使白菜中氯氰菊酯的降解率達到62.07％，土壤中氯氰菊酯的降解率達到51.86％。
榮譽表彰
2017年12月11日，《一株紅細菌菌株及其套用》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
