《p120-catenin調控巨噬細胞自噬在膿毒症中的作用及機制研究》是依託武漢大學，由宋學敏擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：p120-catenin調控巨噬細胞自噬在膿毒症中的作用及機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：宋學敏
- 依託單位：武漢大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
膿毒症是重症醫學領域常見的臨床綜合徵和治療難題。p120-catenin是新近發現的連環蛋白家族新成員，我們前期研究發現，利用siRNA沉默p120，巨噬細胞在自然狀態和LPS誘導後自噬蛋白LC3-II表達均明顯升高；IL-18產生顯著降低，進一步研究發現，p120能與負調控蛋白mTOR相結合。為此我們提出假設：p120可能參與調控巨噬細胞自噬，進而影響膿毒症的進程。本課題擬通過LPS刺激巨噬細胞和盲腸結紮穿孔複製膿毒症模型，觀察p120基因敲除和過表達後巨噬細胞、膿毒症小鼠肝肺組織TLR4/TRIF-mTOR表達，p120與mTOR、ULK1免疫共定位，自噬相關基因ULK1、Atg5-atg12-atg16和LC3-I/II水平，活性氧ROS、Caspase-1、IL-1β和IL-18等產生，進一步闡明p120-catenin調控巨噬細胞自噬在膿毒症中的分子作用機制。
結題摘要
自噬是機體細胞通過溶酶體過程降解和再利用細胞蛋白的自我更新過程，對機體能量平衡和細胞內穩態至關重要。在機體感染過程中，自噬還可通過調節抗原呈遞、淋巴細胞發育、炎性細胞因子產生、病原微生物包裹和清除，在天然免疫中發揮重要作用。研究表明，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）可誘導巨噬細胞自噬，在巨噬細胞炎性反應中發揮作用。p120連環蛋白是內皮細胞和其他極化貼壁細胞中貼壁連線的重要成分。在本課題中，我們利用LPS刺激J-774A.1、小鼠BMDMs巨噬細胞，誘導小鼠巨噬細胞自噬反應，利用基因沉默技術，通過Lipofectamine® RNAiMAX Reagent把p120siRNA成功導入到離體培養小鼠J-774巨噬細胞，在LPS誘導後，western blot 檢測0.1 µg /ml LPS刺激後1h、2h和4h自噬蛋白標誌物LC3-I/II的表達。以及0.05，0.1和0.2 µg /ml LPS刺激後4 h自噬蛋白標誌物LC3-I/II的表達。表明p120基因沉默可致 LPS刺激後LC3-II表達明顯降低，且呈時間和劑量依賴性。免疫螢光共聚焦顯微技術檢測具有相似的觀察結果，免疫共沉澱結果顯示p120可與LC3-I/II結合，而且LPS刺激後兩者作用加強。免疫螢光共聚焦顯微鏡技術觀察發現相似的結果，表明p120可能是自噬體的一部分，參與了自噬體形成。另外，我們利用0.1 µg/ml LPS刺激J-774巨噬細胞和p120-catenin基因缺陷型小鼠BMDMs細胞，採用Co-IP技術檢測p120-catenin可與自噬信號通路負調控蛋白mTOR之間發生相互作用。以及mTOR與ULK1之間的的相互作用，p120-catenin基因缺陷對ULK1-FIP200-Atg13複合物穩定性影響，結果表明p120-catenin基因敲除增強了mTOR與ULK1之間的相互作用，但不干擾ULK1與FIP200-Atg13複合物的穩定性；p120 基因敲除也增強了LPS誘導的肺泡巨噬細胞p-ULK1(757)的磷酸化激活。p120通過激活自噬，進而抑制細胞凋亡的發生。我們利用GFP-p120轉染J774A.1巨噬細胞，0.1μg/ml LPS誘導4h，結果發現LPS誘導後J774A.1巨噬細胞自噬明顯增強，p120的過表達對LPS誘導的巨噬細胞自噬發揮促進作用；
