ilvD基因影響結核菌株H37Ra毒力減弱的作用機制研究

《ilvD基因影響結核菌株H37Ra毒力減弱的作用機制研究》是依託復旦大學，由王森擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：ilvD基因影響結核菌株H37Ra毒力減弱的作用機制研究
• 依託單位：復旦大學
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：王森

項目摘要

闡明結核桿菌減毒株H37Ra毒力減弱的機制對明確結核分枝桿菌野生株致病機制具有重要意義。申請人課題組前期工作發現與有毒株H37Rv比較，減毒株H37Ra中存在ilvD基因的突變，進一步對H37Ra回補Rv株的ilvD基因後，發現可回復減毒株的毒力，並在感染小鼠實驗模型中得到了證實。為了明確ilvD是否為H37Ra毒力減弱中的一個關鍵基因, 以及ilvD基因影響結核分枝桿菌毒力的分子機制，本課題擬通過基因表達的檢測，基因酶活分析等技術考察H37Ra中ilvD的表達，以及突變對基因功能的影響；通過構建H37Rv中ilvD基因缺失突變株H37Rv:△ilvD以及相應回補表達株，考察H37Rv:△ilvD在體外壓力環境中的生長，體內生存以及病理的情況，最終闡明ilvD基因影響H37Ra毒力減弱的分子機制，為尋找新的抗結核藥物靶標及疫苗開發奠定基礎。

結題摘要

結核病目前仍然是世界範圍危害人類健康的主要傳染病之一。闡明結核分枝桿菌減毒株的毒力減弱機制對明確結核桿菌的致病機制具有重要意義。本課題主要研究ilvD基因對結核桿菌毒力的影響及其引起毒力減弱的分子機制。本課題首先完成了結核桿菌H37Rv ilvD蛋白的克隆表達與純化，證實了ilvD在結核桿菌內的功能是發揮二氫酸脫水酶(DHAD)活性，並完成了酶動力學的分析。通過體外的表型檢測，我們發現ilvD基因的缺失會導致分枝桿菌發生支鏈胺基酸（BCAA）營養缺陷，導致ilvD敲除株的生長曲線收到了明顯抑制，在培養基中加入三種BCAA的添加劑後ilvD敲除株的生長能夠基本恢復到野生株的表型。ilvD基因的缺失也會明顯降低分枝桿菌對氧化壓力的應答。通過構建H37Rv ilvD敲除與回復菌株，我們在細胞實驗和小鼠感染模型中均證實了ilvD缺失菌株在巨噬細胞或小鼠體內（肺臟和脾臟）的存活率和增殖能力較野生株明顯下降，毒力明顯減弱。ilvD回復菌株則能夠恢復與野生株同樣的存活和增值能力，明確了ilvD是影響H37Rv毒力的關鍵基因。本課題也研究了ilvD基因影響結核桿菌毒力和巨噬細胞記憶體活能力的分子機制，證實了ilvD是NO在巨噬細胞內發揮對分枝桿菌殺傷作用的關鍵作用靶點。NO通過抑制ilvD的酶活功能，阻斷BCAA的代謝和合成，最終影響了細菌的增殖和存活。我們的研究同時發現，NO對ilvD的抑制作用主要發生在處於對數生長期的細菌，能夠明顯降低其在巨噬細胞內的增殖和存活能力。此外，我們也對ilvD重組蛋白在結核病血清學診斷中的價值和套用進行了評估，證實了ilvD作為血清學診斷抗原，其特異性抗體IgG診斷活動性結核病的敏感性為66.4%，特異性為91.6%，與其它血清學診斷抗原聯用，能夠明顯提高結核病診斷的準確率。我們的發現有助於闡明ilvD及BCAA代謝通路對結核桿菌毒力及存活的影響和機制，為尋找新的抗結核藥物靶標及疫苗開發奠定基礎。