ds-cDNA

ds-cDNA是基因文庫技術中，通過mRNA反轉錄所獲得的cDNA（第一鏈），依靠DNA聚合酶，在一定條件下所延伸的與cDNA相互補的第二條cDNA鏈的英文簡稱。

通過ds-cDNA的合成，可以得到源mRNA的雙鏈cDNA模板，用於後續的酶切處理和基因文庫的建立。

定義

ds-cDNA是基因文庫技術中，通過mRNA反轉錄所獲得的cDNA（第一鏈），依靠DNA聚合酶，在一定條件下所延伸的與cDNA相互補的第二條cDNA鏈的英文簡稱。

合成方法

以下合成方法涵蓋了ds-cDNA的基本合成手段，具體操作中往往由於實驗條件和所用試劑的不同，進行適當調整。

cDNA的合成

1）在Ependorf管中加50pmol/L的一種α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg），100m mol/L甲基氫氧化汞1μl，室溫反應l0分鐘，使RNA變性。
2)加100m mol/L的β-巰基乙醇2μl和10m mol/L RNA酶抑制劑2μl，室溫放置5分鐘。β-巰基乙醇有穩定逆轉錄酶活性的作用。
3)向上述反應混合物加lmg/ml的引物01igo dT(12～18聚體)10μl，1mol/L Tris.HCl(pH8.3)5μl，11mol/L KCl7μl，250m mol/L MgCl22μl，再加20 m mol/L的4種dNTP各2.5μl，逆轉錄酶2μl（40單位），用水補充到50μl，充分混勻，42℃反應1～3小時。
4)加0.5 EDTA(pH8.0)2μl終止反應，然後加150m mol/L NaOH 25μl，65℃反應1小時，或37℃8小時，水解mRNA模板，得到cDNA第一鏈，再加pH8.0，1m mol/L Tris.HCl，各25μl中和其pH。
5)測定放射活性，計算合成的DNA量。實際上，cDNA第一鏈的產量往往不會超過poltAmRNA用量的10%～30%。
6)用等體積的酚-氯仿抽提―次，取水相併用SephadexG-100離心柱層析(參看第6章)將cDNA同剩餘的dNTP分開，以2.5倍體積的95%冷乙醇沉澱。
7)合成的cDNA第―鏈在1.4%的鹼性瓊脂糖凝膠上電泳，用末端標記的pBR322限制性片段為分子量標準，電泳後，鋪X-光片，進行放射自顯影，確定cDNA第一鏈的大小。

ds-cDNA的合成

1）第一鏈合成完畢後，直接進行第二鏈的合成。在第一鏈合成體系中分別加入
2.5×第二鏈緩衝液40μl，
DNA聚合酶Ⅰ23μ（或者T4-DNA聚合酶）
RNase H 0.8μ
加水至100μl

註：具體體系的配置，可依照實驗用量和不同廠家的試劑酌情變更。

2）14-16℃下放置2小時。(>3Kb時反應時間延長至3-4小時)
3）70℃，10min，點動離心,置於冰浴
4） 在樣品管中加入T4DNA聚合酶2μ,37放置10分鐘。
5）加入4μl 500mM的EDTA到該樣品管中,然後置於冰浴上.
6） 等體積加入酚\氯仿\異戊醇抽上清,12000g，3min。
7） 上清液轉移至一乾淨試管,加2V乙醇,1/10V乙酸鈉，-20℃30min沉澱,12000g，15min收集沉澱，70%乙醇洗沉澱,乾燥,TE復溶。

也可以選擇試劑盒方法，如Promega的Universal RiboClone cDNA Synthesis System，裡面就包含從RNA反轉錄成cDNA第一鏈，以及合成cDNA第二鏈所需的試劑。