ada(腺苷脫氨酶)

腺苷脫氨酶（Adenosine deaminase）是一種參與嘌呤代謝作用的酶。它是用作拆解食物組織中的核酸中的腺苷。在人體中，它主要參與了免疫細胞的製造；若該酶突變，會造成T細胞、B細胞、自然殺手細胞皆無法表現的嚴重複合型免疫缺乏症(SCID)

基本介紹

• 中文名：ada
• 外文名：EC：3.5.4.4 adenosine deaminase ADA
• 定義：腺苷脫氨酶
• 分布：人體組織中

簡介

腺苷脫氨酶（也稱為腺苷氨基水解酶，或ADA）是參與嘌呤代謝的酶（EC3.5.4.4）。它需要從食物中分解腺苷和組織中核酸的轉換。它在人體中的主要功能是免疫系統的發育和維持。然而，ADA的完整生理作用尚未完全了解。

結構

ADA以小形式（作為單體）和大形式（作為二聚體 - 複合物）存在。在單體形式中，酶是多肽鏈，摺疊成8股平行的α/β桶，其圍繞作為活性位點的中央深口袋。除8箇中心β-桶和8個外周α-螺旋外，ADA還含有5個額外的螺旋：殘基19-76倍折成三個螺旋，位於β1和α1摺疊之間;兩個反平行的羧基末端螺旋位於β-桶的氨基末端。

ADA活性位點含有鋅離子，鋅離子位於活性位點的最深凹陷處，由來自His15，His17，His214，Asp295和底物的五個原子配位。鋅是活動所必需的唯 一輔助因子。

底物腺苷被穩定並通過9個氫鍵與活性位點結合。與基質嘌呤環大致共面的Glu217的羧基在適當位置與基質的N1形成氫鍵。Asp296的羧基也與底物嘌呤環共面，與底物的N7形成氫鍵。Gly184的NH基團處於與底物的N3形成氫鍵的位置。Asp296與Zn形成鍵離子以及底物的6-OH。His238也與底物6-OH形成氫鍵。底物核糖的3'-OH與Asp19形成氫鍵，而5'-OH與His17形成氫鍵。在活性位點的開口處，通過基質的2'-OH和3'-OH，在水分子上形成另外兩個氫鍵。

由於酶內活性位點的凹陷，基質一旦結合，幾乎完全與溶劑隔離。當結合時，基材對溶劑的表面暴露是自由狀態下基材的表面暴露的0.5%。

反應

ADA不可逆地使腺苷脫氨基，通過用氨基取代酮基將其轉化為相關的核苷肌苷。

然後肌苷可被另一種稱為嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的酶衍生化（從核糖中除去），將其轉化為次黃嘌呤。

催化機理

所提出的ADA催化脫氨作用機理是通過四面體中間體進行立體特異性加成 - 消除。通過任何一種機制，作為強親電試劑的Zn激活水分子，水分子被鹼性Asp295去質子化以形成攻擊性氫氧化物。His238定向水分子並穩定攻擊氫氧化物的電荷。將Glu217質子化以將質子提供給底物的N1。

由於鋅，Asp295和His238殘基的位置，反應是立體特異性的，其全部面向底物的嘌呤環的B側。

已經觀察到對ADA的競爭性抑制，其中產物肌苷作用於競爭性抑制劑對酶活性起作用。

功能

ADA被認為是嘌呤代謝的關鍵酶之一。該酶已在細菌，植物，無脊椎動物，脊椎動物和哺乳動物中發現，具有高度的胺基酸序列保守性。高度的胺基酸序列保守性表明ADA在嘌呤補救途徑中的關鍵性質。

首先，人類的ADA參與免疫系統的發育和維持。然而，還觀察到ADA關聯與上皮細胞分化，神經傳遞和妊娠維持有關。還提出，除腺苷分解外，ADA還刺激興奮性胺基酸的釋放，並且是A1腺苷受體和異源三聚體G蛋白偶聯所必需的。腺苷脫氨酶缺乏會導致肺纖維化，表明長期暴露於高水平的腺苷可以加劇炎症反應而不是抑制它們。還已經認識到腺苷脫氨酶蛋白和活性在過表達HIF-1α的小鼠心臟中上調，這部分地解釋了在缺血應激期間表達HIF-1α的心臟中腺苷的減弱水平。

病理學

腺苷脫氨酶基因中的一些突變導致它不被表達。由此產生的缺陷是嚴重聯合免疫缺陷（SCID）的一個原因，特別是常染色體隱性遺傳。ADA水平不足也與肺部炎症，胸腺細胞死亡和T細胞受體信號缺陷有關。

相反，導致該酶過度表達的突變是溶血性貧血的一個原因。

有證據表明不同的等位基因（ADA2）可能導致自閉症。

ADA水平升高也與愛滋病有關。

異構體

有兩種ADA同種型：ADA1和ADA2。

ADA1存在於大多數體細胞中，特別是淋巴細胞和巨噬細胞中，它不僅存在於胞質溶膠和細胞核中，而且還存在於與二肽基肽酶-4（aka，CD26）連線的細胞膜上的外胚層中。ADA1主要參與細胞內活動，並且以小形式（單體）和大形式（二聚體）存在。小型到大型的相互轉換受肺中“轉換因子”的調節。

ADA2首次在人類脾臟中發現。隨後在包括巨噬細胞在內的其他組織中發現它與ADA1共存。這兩種同種型調節腺苷與脫氧腺苷的比例，增強了寄生蟲的殺滅。ADA2主要存在於人血漿和血清中，並且僅作為同型二聚體存在。

臨床意義

ADA2是人血漿中存在的主要形式，並且在許多疾病中增加，特別是與免疫系統相關的疾病：例如類風濕性關節炎，牛皮癬和結節病。在大多數癌症中血漿ADA2同種型也增加。ADA2不是普遍存在，而是僅在單核細胞 - 巨噬細胞中與ADA1共存。

可以使用高效液相色譜法或酶法或比色法測量總血漿ADA。也許最簡單的系統是測量腺苷在分解為肌苷時釋放的氨。在用腺苷的緩衝溶液溫育血漿後，氨與Berthelot試劑反應形成藍色，其與酶活性的量成比例。為了測量ADA2，在孵育之前加入赤 - 9-（2-羥基-3-壬基）腺嘌呤（EHNA）以抑制ADA1的酶活性。缺乏ADA1引起SCID。

ADA也可用於淋巴細胞性胸腔積液或腹膜腹水的檢查，因為這種低ADA水平的樣本基本上不考慮結核病。

結核性胸腔積液現在可以通過增加胸膜液腺苷脫氨酶水平，每升40 U以上來準確診斷。

克拉屈濱和Pentostatin是用於治療毛細胞白血病的抗腫瘤劑;它們的作用機制是抑制腺苷脫氨酶。

檢測方法演變

近十幾年來，隨著對ADA的深入研究，檢測方法也不斷發展。目 前已發展了四代。

第一代ADA測試

ADA將腺苷 （Adenosine） 脫氨產生次黃苷（Inosine） 和氨 （NH3）。一個ADA活性單位在測試特定條件下每分鐘脫氨1μmole腺苷成為次黃苷。通過動態測量腺苷265nm處吸光度下降的速度，可以測算ADA的活性大小。Kaplan法 （1955） 由此建立。由於高底物濃度造成吸光度過高，該法僅適用於腺苷濃度低於40μM。如此低的底物濃度達不到底物飽和要求，造成ADA活性檢測失真。因此，該法不適用於臨床套用。

第二代ADA測試

原理為腺苷脫氨酶催化腺嘌呤核苷水解，產生次黃嘌呤核苷和氨。然後用Berthelot顯色反應（1859）測定反應過程中產生氨的量，從而計算血清ADA活性單位。所需試劑易配製，儀器簡單，但靈敏度低，易受外源性NH3影響，空白過高，不能直接測定紅細胞ADA活性。

同樣原因，ADA偶聯谷氨酸脫氫酶（Glutamate Dehydrogenase， GLDH）反應：

通過測量340nm處NADPH吸光度下降的速度來測算ADA活性。該法也因血清含氨干擾，以及測試系統中過高NADPH造成非特異性氧化而無成算。

第三代ADA測試

Kalckar氏套用ADA偶聯嘌呤核苷磷酸化酶（Purine nucleoside phosphorylase，PNP） 和黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase， XOD） 反應連續監測法。通過測量293nm處尿酸鹽吸光度上升的速度來測算ADA活性。

但是，293nm時血清吸光度太高，造成臨床套用不便。

第四代ADA測試

通過ADA偶聯PNP，XOD，過氧化氫酶（Catalase）和醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase），藉助過氧化氫（H2O2）反應測量334nm處NADPH吸光度上升的速率來測算ADA活性。該法克服了以往ADA測試的困難，然而，鑒於試劑成本高，阻礙實際臨床使用。

最新對第四代測試方法的改進為偶聯PNP，XOD和過氧化物酶（Peroxidase， POD）反應。ADA酶解腺苷（Adenosine）脫氨產生次黃苷（Inosine）；再通過PNP的作用，生成次黃嘌呤（Hypoxanthine）；後者在XOD氧化下生成尿酸（Uric Acid）和過氧化氫（H2O2）；最後在POD的作用下H2O2再與N-Ethyl-N-（2-hydroxy-3-sulfopropyl）-3-methylaniline （EHSPT）、4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine， 4-AA）反應（Trinder氏反應），生成紫紅色的有色醌（Quinone dye）。通過動態測量有色醌550nm處吸光度上升的速度來測算ADA的活性。從反應原理可知NH4+對該法無影響。其原理反應方程式如下：

反應具有測定精密度高，抗干擾能力強，適合自動化快速測定的特點，為臨床常規開展ADA檢測套用創造了有利條件。

邁克腺苷脫氨酶（ADA）檢測試劑盒性能指標

檢測方法：XOD-PAP法（第四代改良法），不與其它核苷反應，無NH4+影響，靈敏度高。

劑 型：液體雙試劑，直接使用，避免復溶引起瓶間差。

線性範圍：0～200U/L，γ2≥0.99

準 確 度：不準確度正常水平≤15%，異常水平≤10%。

穩 定 性：密閉避光貯存2～8℃可穩定12個月，開瓶上機2～8℃避光穩定30天。

抗干擾能力：標本中膽紅素≤342umol/L，血紅蛋白≤200mg/dl，甘油三酯≤8.47mmol/L，抗壞血酸≤4mg/dl 及NH4+對本試劑測定無影響。

適 用 性：適用於各種半/全自動生化分析儀。

參考範圍：4～22U/L（37℃），建議各實驗室建立自己的參考值範圍。