TUNEL檢測

基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上螢光素 (FITC) 標記的dUTP (fluorescein-dUTP) ，從而可以通過螢光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，這就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法檢測細胞凋亡的原理。

基本介紹

• 中文名：TNUEL檢測
• 外文名：TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling

原理

細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發現180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上螢光素 (FITC) 標記的dUTP (fluorescein-dUTP) ，從而可以通過螢光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，這就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法檢測細胞凋亡的原理。

實驗方法

對於貼壁細胞或細胞塗片

a. PBS或HBSS洗滌一次。

b. 如果細胞貼得不牢，可以乾燥樣品使細胞貼得更牢。

c. 用4%多聚甲醛或碧雲天生產的免疫染色固定液(P0098)固定細胞30-60分鐘。

d. 用PBS或HBSS洗滌一次。

e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。

f. 轉步驟5。

對於懸浮細胞或細胞懸液

a. 收集細胞(不超過200萬細胞)，PBS或HBSS洗滌一次。

b. 用4%多聚甲醛固定細胞30-60分鐘。為防止細胞聚集成團，宜在側擺搖床或水

平搖床上緩慢搖動的同時進行固定。

c. 用PBS或HBSS洗滌一次。

d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重懸細胞，冰浴孵育2分鐘。

e. 轉步驟5。

對於石蠟切片

a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。

b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的最佳作用溫度和時間需自行摸索)。

c. PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌乾淨，否則會嚴重干擾後續的標記反應。

d. 轉步驟5。

對於冷凍切片

a. 用4%多聚甲醛固定細胞30-60分鐘。

b. PBS或HBSS洗滌2次，每次10分鐘。

c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。

d. 轉步驟5。

配製TUNEL檢測液

參考下表配製適當量的TUNEL檢測液，需充分混勻。注意：配製好的TUNEL檢測液必須一次使用完畢，不能凍存。

	1個樣品	5個樣品	10個樣品
TdT酶	2μl	10μl	20μl
螢光標記液	48μl	240μl	480μl
TUNEL檢測液	50μl	250μl	500μl

對於貼壁細胞、細胞塗片或組織切片

a. 用PBS或HBSS洗滌2次。

b. 在樣品上加50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。注意：孵育時需注意在周圍用浸足水的紙或藥棉等保持濕潤，以儘量減少TUNEL檢測液的蒸發。

c. PBS或HBSS洗滌3次。

d. 用抗螢光淬滅封片液封片後螢光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長範圍為450-500nm，發射波長範圍為515-565nm(綠色螢光)。

對於懸浮細胞或細胞懸液

a. 用PBS或HBSS洗滌2次。

b. 加入50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。

c. PBS或HBSS洗滌2次。

d. 用250-500μl PBS或HBSS懸浮。

e. 此時可以用流式細胞儀進行檢測或塗片後在螢光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長範圍為450-500nm，發射波長范

圍為515-565nm(綠色螢光)。

常見問題

出現非特異性螢光標記

a. 有些細胞或組織，例如平滑肌細胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導致出現非特異性的螢光標記。解決方法是，取細胞或組織後立即固定並且要充分固定，以阻止這些酶導致假陽性。

b. 使用了不適當的固定液，例如一些酸性固定液，導致出現假陽性。建議採用推薦的固定液。

c. TUNEL檢測反應時間過長，或TUNEL檢測反應過程中反應液滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現非特異性螢光。注意控制反應時間，並確保TUNEL檢測反應液能很好地覆蓋樣品。

螢光背景很高

a. 支原體污染。請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。

b. 高速分裂和增殖的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA斷裂。

c. TUNEL反應過強。可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍後再按照說明書操作。稀釋後的TdT酶需當日使用。

d. 紅細胞中血紅蛋白導致的自發螢光產生嚴重干擾。此時宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒。

標記效率低

a. 使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低。

b. 固定時間過長，導致交聯程度過高。此時宜減少固定時間。

c. 螢光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴重淬滅。解決方法是需注意避光操作。

d. 碘化丙啶雙染時，如果碘化丙啶染色過深會導致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發產生的螢光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。

例圖

作者自製，不得移做他用！

Control

Experiment