T4DNA連線酶

DNA連線酶是1967年在三個實驗室同時發現的。它是一種封閉DNA鏈上切口酶，藉助ATP或NADP水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的(T4DNA連線酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連線酶催化形成磷酸二酯鍵。

基本介紹

• 中文名：T4DNA連線酶
• 發現時間：1967年
• 性質：生物
• 類別：酶

基本特性

大腸桿菌的DNA連線酶是一條分子量為75KD的多肽鏈。對胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解後形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶與NAD(而不是ATP)反應形成酶-AMP中間物，但不能繼續將AMP轉移到DNA上促進磷酸二酯鍵的形成。

DNA連線酶在大腸桿菌細胞中約有300個分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子數相近，這也是比較合理的現象。因為DNA連線酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填滿雙鏈DNA上的單鏈間隙後封閉DNA雙鏈上的切口。這在DNA複製、修復和重組中起著重要的作用，連線酶有缺陷的突變株不能進行DNA複製、修復和重組。噬菌體T4DNA連線酶分子也是一條多肽鏈，分子量為60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。

此酶的催化過程需要ATP輔助。T4DNA連線酶可連線DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。另外，NH4C1可以提高在大腸桿菌DNA連線酶的的催化速率，而對T4DNA連線酶則無效。無論是T4DNA連線酶，還是大腸桿菌DNA連線酶都不能催化兩條游離的DNA鏈相連線。

主要種類

常用的DNA連線酶有兩種：來自大腸桿菌的DNA連線酶和來自噬菌體的T4DNA連線酶。二者的作用機理類似。T4連線酶作用分三步：

(1) T4DNA連線酶與輔助因子ATP形成酶－AMP複合物。

(2) 酶－AMP複合物結合到具有5’－磷酸基和3’－羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化。

(3) 產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來.

作用機制

T4DNA連線酶作用機制：分子生物學試驗中主要採用T4DNA連線酶，因該酶在正常條件下，即能完成連線反應。T4 DNA 連線酶是一單鏈多肽，分子量為68,000道爾頓，它能催化雙鏈DNA上相鄰的3ˊ羥基和5ˊ磷酸末斷形成磷酸二脂鍵。λDNA用EcoRI酶切割後形成的6個片斷均具有粘性末端（Cohesive ends），在T4 DNA 連線酶作用下，可連線成原來的線狀DNA。

T4DNA連線酶連線要求和結果

外源DNA末端性質	連線要求	連線結果
不對稱粘性末端	兩種限制酶消化後，需純化載體以提高連線效率	載體與外源DNA連線處的限制酶切位點常可保留；非重組克隆的背景較低；外源DNA可以定向插入到載體中。
對稱性粘性末端	線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理	載體與外源DNA連線處的限制酶切位點常可保留；重組質粒會帶有外源DNA的串聯拷貝；外源DNA會以兩個方向插入到載體中。
平端	要求高濃度的DNA和連線酶	載體與外源DNA連線處的限制酶切位點消失；重組質粒會帶有外源DNA的串聯拷貝；非重組克隆的背景較高 。