《Sphingmonas wittichii DP58 降解吩嗪-1羧酸的代謝機制研究》是依託上海交通大學，由胡洪波擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：Sphingmonas wittichii DP58 降解吩嗪-1羧酸的代謝機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：胡洪波
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
申嗪黴素是一種新型、高效的生物源農藥，但其有效成分吩嗪-1-羧酸（PCA）在環境中的代謝行為目前還鮮有報導。本課題以一株能高效降解PCA 的Sphingomonas wittichii DP58 為研究對象，以PCA降解代謝途徑中的初始關鍵酶為核心，擬在分子和生化水平上闡明該菌株降解PCA 的代謝機制。首先結合課題組前期基因文庫篩選和基因組測序結果，通過RT-PCR、基因敲除和異源表達實驗確定該菌株降解PCA 的初始芳烴羥化雙加氧酶，並研究該酶的生化特性以及催化機制。然後對該酶基因的上下游基因進行功能分析，異源表達其中與PCA 降解密切相關的基因，同時添加13C標記的PCA，通過酶催化實驗來解析和完善該菌株降解PCA 的代謝途徑。本研究一方面為申嗪黴素的安全使用提供基礎數據，另一方面為提高申嗪黴素的防治效果奠定紮實的理論基礎，同時對其他含氮雜環化合物的降解研究具有重要的參考價值。
結題摘要
申嗪黴素是一種新型高效的生物源農藥，但其有效成分吩嗪-1-羧酸（PCA）在環境中的代謝行為目前還鮮有報導。本課題首先對一株能高效降解PCA 的菌株Sphingomonas wittichii DP58 進行PCA降解時的轉錄組分析，發現表達上調倍數最大的3個加氧酶編碼基因位於同一個基因簇中。接著通過系統發育分析，發現其中的一個雙加氧酶PcaA1屬於苯甲酸類降解雙加氧酶，表明PcaA1A2可能兼有PCA脫羧功能。再通過異源表達和全細胞轉化研究，發現只有基因pcaA1A2A3A4一起表達時才能將PCA轉化為1,2-二羥基吩嗪。說明pcaA1A2A3A4編碼PCA降解的芳烴羥化初始雙加氧酶（命名為PCA 1, 2-雙加氧酶）。其功能是催化PCA脫羧和羥基化形成1, 2-二羥基吩嗪。為了進一步研究PCA 1, 2-雙加氧酶的催化特點和酶學特性，我們分別將pcaA1A2、 pcaA3和pcaA4克隆並進行異源表達和純化。 SDS-PAGE分析發現，PcaA1A2由兩個亞基組成，其分子量約為46和17 kDa。體外酶促反應結果表明，PcaA1A2、PcaA3和PcaA4是轉化PCA必需蛋白，說明PCA 1, 2-雙加氧酶是IV型三組份雙加氧酶。PCA 1, 2-雙加氧酶可以利用NADH和NADPH為電子供體，但使用NADH為電子供體時酶催化活性是使用NADPH的20倍。凝膠過濾分析發現PcaA1A2的活性蛋白分子量為190 kDa，說明該酶是α3β3的組成結構。對PCA 1, 2雙加氧酶進行底物專一性分析發現，PCA 1, 2-雙加氧酶還可以轉化鄰羥基苯甲酸為鄰苯二酚，但不能轉化苯甲酸和2-OH-PCA。另外，為了驗證菌株S. yanoikuyae B1中編碼聯苯雙加氧酶基因bphA1fA2fA3A4是否可以催化吩嗪的加氫和羥基化，我們在大腸桿菌中異源表達了該基因並進行全細胞催化。結果表明，該雙加氧酶可以將吩嗪轉化為1, 2-二氫 1, 2-二羥基吩嗪。另外，對菌株B1中的基因bphA1f敲除和回補的實驗表明基因bphA1fA2f是菌株B1中吩嗪降解的唯一初始雙加氧酶編碼基因。本研究一方面為申嗪黴素的安全使用提供基礎數據，另一方面為提高申嗪黴素的防治效果奠定紮實的理論基礎，同時對其他含氮雜環化合物的降解研究具有重要的參考價值。
