《PIWI蛋白介導的piRNAs在雞精子發生中的功能研究》是依託揚州大學，由常國斌擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：PIWI蛋白介導的piRNAs在雞精子發生中的功能研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：常國斌
- 依託單位：揚州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
PIWI蛋白介導的piRNAs在表觀遺傳和轉錄初水平的調控是生殖幹細胞維持、配子形成以及胚胎早期發育的關鍵因素。與哺乳動物相比，雞胚胎髮育體外可見且易於人工操作，配子獲得簡單。本研究利用Q-PCR和免疫印記技術檢測雞胚生殖幹細胞和精子發生過程中PIWI蛋白的表達水平；同時分別構建雞無精症和PIWI突變體細胞模型（通過TALEN和shRNA干擾技術），利用RNA-蛋白質免疫沉澱技術釣取與PIWI蛋白特異性結合的piRNAs，純化後用於Hiseq2000分析。經生物信息學分析與注釋，獲得減數分裂前期和減數分裂過程中piRNAs的起源發生、調控功能及相關信號通路。最後，通過Nepa高效轉染系統在細胞和個體水平進行候選piRNAs抑制和mimic分析,檢測生殖幹細胞的增殖、分化狀態以及精子成熟過程中的變化，最終揭示piRNAs及PIWI蛋白在雞精子發生中的功能與調控機制。
結題摘要
PIWI蛋白介導的piRNAs在表觀遺傳和轉錄初水平的調控是哺乳動物生殖幹細胞維持、配子形成以及胚胎早期發育的關鍵因素，但在家禽中尚是空白。本研究首次克隆了家禽特有的Piwi基因-Piwi like 1 (Piwil1)序列及其結構特徵，證實了雞piRNAs能特異性結合PIWI蛋白，主要來源於基因及轉錄因子結合位點。雞Piwil1基因在不同生精細胞的表達量受到NF-Y和CpG島甲基化程度共同調控。Piwil1基因具有抑制轉座子CR1-F活性的功能，體內、體外抑制(ShRNA)與敲除（CRISPR-Cas9）Piwil1基因後早期胚胎、生殖細胞和配子形成發生障礙。通過二代測序篩選到影響禽類精子發生的減數分裂前期和後期的一批特異性piRNAs，證實了piRNA-19128通過靶向KIT基因調節Melanogenesis信號通路從而參與精子減數分裂的調控機制，最終闡明了雞piRNAs及PIWI蛋白在早期胚胎髮育、精子發生中的功能與作用機理。
