《PDC-MhpF代謝通道構建及代謝流量最佳化機制的研究》是依託山東大學，由梁泉峰擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：PDC-MhpF代謝通道構建及代謝流量最佳化機制的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：梁泉峰
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
構建代謝通道是解決代謝工程研究中最佳化代謝流量這一關鍵問題的有效方法之一。而構建代謝通道的手段各有優缺點，其最佳化代謝流的作用機制也不十分清楚。在我們構建的厭氧合成重要平台化合物琥珀酸的基礎菌株中，由丙酮酸脫羧酶PDC和乙醛脫氫酶MhpF催化的丙酮酸生成乙醯輔酶A過程代謝流量的最佳化，是提高琥珀酸轉化率和改善氧化還原平衡的關鍵。為此本項目首次採用分子定向進化和蛋白骨架兩種策略構建PDC-MhpF代謝通道最佳化代謝流。利用酶學特性分析、蛋白結構預測、代謝物檢測和代謝通道分析的方法，揭示代謝通道最佳化代謝流的作用機制以及雜合酶融合的分子機理，比較兩種代謝通道構建手段對代謝流最佳化的結果；進一步利用13C代謝流分析該代謝通道對琥珀酸厭氧合成途徑的作用和影響，為下一步改造提供研究方向。本項目開展的代謝通道構建和最佳化代謝流量的作用機制的研究，可以為代謝工程研究中增強和最佳化代謝流量，提供一個新的手段和理論基礎。
結題摘要
在代謝工程的研究中，最佳化代謝流量已成為代謝工程研究中的關鍵問題。琥珀酸是一種具有重要套用價值的四碳二羧酸。美國能源部2004年從300多種生物中間體中挑選出來的12種具有市場潛力的平台化合物中，琥珀酸位居第一。在我們構建的合成重要平台化合物琥珀酸的基礎菌株中，代謝流量的控制和最佳化是提高琥珀酸轉化率和改善氧化還原平衡的關鍵。本項目從四個方面針對上述問題進行了研究，並取得較好結果： （一） PDC和MhpF代謝流量的最佳化：由丙酮酸脫羧酶PDC和乙醛脫氫酶MhpF催化的丙酮酸生成乙醯輔酶A過程代謝流量的最佳化，是提高琥珀酸轉化率和改善氧化還原平衡的關鍵。針對PDC和MhpF的代謝流量的最佳化，我們採用了的兩種策略，PDC-MhpF融合酶的構建以及利用一種新的串聯核心啟動子方法最佳化代謝流量。使琥珀酸厭氧生產得到顯著提高。 （二）TCA還原支路和糖酵解的代謝流量最佳化。通過調控最佳化TCA還原支路和糖酵解代謝流分配和加快碳源葡萄糖的跨膜運輸，好氧-微好氧-厭氧全階段生產琥珀酸的產量達到32.30g/L，這一產量較單一好氧生產提高4.33倍，較好氧-微好氧雙階段生產提高1.93倍。最終發酵罐結果顯示，工程菌的琥珀酸產量達到85.3 g/L，特別是總生產力（2.13 g/(L▪h)）是目前利用大腸桿菌生產琥珀酸相關文獻報導中最高的。因此工程菌和好氧-微好氧-厭氧全階段琥珀酸發酵工藝具有可觀的工業化套用價值和前景。 （三）糖運輸和PEP代謝流量的最佳化。首次較為系統地探究了大腸桿菌W3110菌株的PTSGlc單基因缺陷菌株對不同碳源的運輸流量的調控和影響。可以在發酵含不同比例葡萄糖和木糖的生物質水解液過程中，選擇適合的菌株以提高目的產物的生產效率。在厭氧條件W3110H菌株具有非常明顯的積累琥珀酸的優勢。進一步的研究證明ptsH的缺失能有效地改變PEP的代謝流量並積累琥珀酸。這一研究對於大腸桿菌厭氧發酵琥珀酸有重要的意義。 （四）氧化還原平衡的最佳化。從好氧轉到厭氧發酵琥珀酸的過程中，工程菌存在氧化還原不平衡的問題。我們通過敲除有氧琥珀酸生產中主要的兩個NADH脫氫酶以驅動NDH-I成為有氧琥珀酸生產中NADH氧化的主要參與者。進一步厭氧階段過表達ppsA基因通過ATP無效循環，降低厭氧階段胞內ATP的產生，從而加快厭氧階段葡萄糖消耗，使厭氧琥珀酸產量提高了59%。
