PCR反應循環參數是指在聚合酶鏈式反應中，循環參數中退火溫度和時間、延伸時間及PCR緩衝液的成分影響多重PCR的擴增效果，而反應體積、循環次數對其擴增效果影響較小。多重PCR(mutiplex PCR)技術因具有高效、高產率、能降低實驗成本、加速實驗進程等優點，要求不同引物能在同一反應體系中進行特異性擴增, 因而影響其擴增效果的因素較多, 主要有循環參數、反應體積、反應體系、引物間的鹼基配對等。
基本介紹
- 中文名：PCR反應循環參數
- 外文名：PCR reaction cycle parameters
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內涵
PCR反應參數包括變性溫度和時間、復性溫度和時間、延伸溫度和時間、循環數四方面，在PCR反應過程中都發揮著至關重要作用。
變性溫度和時間
模板DNA和PCR產物的變性不充分是PCR失敗的主要原因。適宜的變性條件是95℃ 30s或97℃ 15s。變性不完全，DNA雙鏈會很快復性，因而減少產量。在變性中，溫度太高或反應時間過長，會導致酶活性的損失。
復性溫度和時間
復性溫度決定PCR的特異性，而引物退火溫度和所需時間長短取決於反應體系中的基本組成及擴增引物的長度和濃度，實際使用的退火溫度要比擴增引物的Tm值低5℃。增加退火溫度會增加引物的識別，同時可降低引物3端核苷酸的錯誤延伸。因此，提高退火溫度，特別是在前幾個循環中，會增加擴增的特異性。而且為了在循環開始獲得最高的特異性，應在第一次變性之後，引物退火之前加入Taq DNA聚合酶。復性時間一般為30～60s。
延伸溫度和時間
引物延伸溫度一般為72℃，延伸的時間決定於擴增模板的長度，小於1kb的片段一般1～2min，而10kb的片段可能需要15min或更長時間。不合適的延伸溫度不僅會影響擴增產物的特異性,亦會影響其產量。
循環數
在25～30個循環內，擴增DNA增加明顯，需要進一步增加產量時，可將第一次PCR產物稀釋後再擴增，而不要盲目增加循環數，以免增加非特異擴增。
