ODNan

ODNan技術是近年認識的在作用方式上不同於反義寡脫氧核苷酸( ODNas)的一種基因表達的調控手段，能與雙鏈DNA分子特異性結合形成局部三螺旋結構，從 而在轉錄水平抑制基因表達1，2。通過三螺旋形成，ODNan充當了切割DNA的“分 子剪刀”，提供了基因治療的新策略。文獻報導ODNan及ODNas在體外能抑制癌基因表達及猿 病毒40複製，但作者尚未見將ODNan套用於抑制B型肝炎病毒(HBV)的研究報 道。因此，我們在22.1.5細胞觀察了針對HBV核心啟動子(HBV Cp)Sp1位點的ODNan及針對HBV 前C、前基因組RNA 5′端起始區的ODNas的抗HBV作用。

基本介紹

• 外文名：ODNan
• 類別：調控手段
• 形成：局部三螺旋結構
• 特點：不同於反義寡脫氧核苷酸

詳細信息

反基因寡脫氧核苷酸技術

ODNas在體外能抑制HBV複製。ODNas的靶點為RNA，在翻譯水平發揮作 用，有一定局限性，若能直接抑制HBV基因轉錄，則抗HBV效果可能更強。ODNan即不同於ODN as，能與含同聚嘌呤嘧啶序列的雙螺旋DNA形成三螺旋結構而直接在轉錄水平發揮抑制作用

HBV Cp 1734 nt～1754 nt存在兩個轉錄因子Sp1位點，是決定HBV Cp活性的 重要部位；該區域為同聚嘌呤嘧啶序列[7]，又具有形成三螺旋的結構特點；此外 ，HBV基因功能，複製特點決定了HBV前基因組RNA 5′端起始區可能是HBV反義治療的最佳靶 點。因此，本文選擇這兩區域為ODNan、ODNas作用靶點，進行抗HBV研究，尚未見類似的研 究報導。

本研究表明ODNan21、ODNas21能明顯抑制HBV複製及抗原合成，並對細胞無毒副作用。其抑 制呈劑量依賴性。兩者聯合套用時抑制作用增強。由於ODNan21作用於轉錄水平，ODNas21作 用於翻譯水平，因此，兩者聯合套用時HBV前C、C基因的轉錄、翻譯及HBV複製三個環節均可 能被抑制故作用增強。該結果提示，作用於HBV生活周期不同環節的藥物聯合套用可能提高 抗HBV效果。

我們設計的ODNan21針對HBV Cp Sp1，作用於轉錄水平；ODNas21作用於翻譯水平。從理論上 看，ODNan21應顯示更強的抑制作用。但本實驗發現，ODNan21對HBeAg、HBsAg的抑制反略低 於ODNas21。其原因不太清楚，可能與所用實驗細胞有關。因為轉錄因子Sp1對HBV Cp活性的 調控呈細胞特異性。在去分化細胞，如Hep G2.1細胞系，Sp1的調控作用較強；而在分化細 胞 ，如Hep G2細胞系（包括22.1.5細胞），Sp1對HBV Cp的調控作用較弱[9]，因此，在 2 2.1.5細胞，即使套用ODNan21封閉了Sp1，對HBV基因表達及複製的抑制也可能不很強。可以 推測，在正常分化的肝細胞中，ODNan21可能顯示出更強的抗HBV作用。

本研究顯示，ODNan及ODNas能有效抑制HBV複製，這無疑為B型肝炎的治療提供了新思路。但這僅是體外的初步研究結果，如何降低合成寡核苷酸的成本；如何將ODNan、ODNas定嚮導 入肝細胞及明確其在動物體內的藥效、藥代動力學等將是今後急需研究的課題。

材料與方法

22.1.5細胞培養

22.1.5細胞為轉染了HBV(ayw亞型）全基因組，能分泌HBsAg、HBeAg、HBV DNA及HBV顆粒的人 肝母瘤細胞系[6]，由第一軍醫大學駱抗先教授惠贈。用含10%胎牛血清及G418（400 μg/ml）的DMEM(Sigma公司產品）培養基按常規方法培養。

硫代磷酸反基因及反義寡核苷酸合成

選擇HBV(ayw)Cp Sp1位點（1734 nt～1754 nt）設計21聚反基因寡核苷酸（ODNan21），序列為T GTGGTGGGGAAGTGGTGGG；以HBV前C、前基因組RNA 5′端起始區（1813 nt～1833 nt）設計21聚 反 義寡核苷酸（ODNas21），序列為CAGAGGTGAAAAAGTTGCATGGT；無關序列對照寡核苷酸（ODNcon) ，序列為GGGTGGTGAAGGG-GTGGTGT。採用固相亞磷醯胺三酯合成法在DNA合成儀（美國AB I公司）上由中國科學院上海細胞生物學研究所協助合成。

抗病毒作用檢測

將22.1.5細胞以2×105 個/孔接種於24孔培養板，同時加入不同劑量ODNan21、ODNas21及 ODNcon,12 h再給藥1次繼續培養，每個濃度做3個復孔。空白對照細胞僅加培養基。每12 h 收集50 μl培養上清液，採用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）（中山生物公司試劑盒）一次性檢 測HBsAg、HBeAg含量，結果以P/N值表示，按下式計算抑制率：

抑制率=（對照孔P/N-實驗孔P/N）÷（對照孔P/N-2.1）×100%

按常規方法抽提各組細胞培養上清液中HBV DNA，以地高辛標記的HBV DNA探針採用斑點雜交 法探針檢測其HBV DNA水平。

細胞毒性試驗

22.1.5細胞傳代培養24 h後，換含不同濃度ODNan21的培養液，每個濃度接種3孔。設不加OD Nan21的22.1.5細胞作對照。繼續培養72 h，採用放射免疫法檢測培養上清中甲胎蛋白水平 ，並觀察細胞生長情況、細胞形態、細胞破壞程度。