《NJA-1菌中DON降解酶的基因定位、克隆和特性研究》是何成華為項目負責人，南京農業大學為依託單位的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：NJA-1菌中DON降解酶的基因定位、克隆和特性研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：何成華
- 依託單位：南京農業大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是飼料中常見的真菌毒素之一，在2007年和2008年飼料的檢測報告中，該毒素的污染率分別高達95.9%和83.1%，嚴重影響了飼料的安全和動物的健康。在申請者以前的研究中，從土壤中分離到一株具有降解DON活性的真菌（NJA-1），經鑑定為塔賓麴黴（DQ9025790）。該菌在體外對DON的生物轉化率高達94.4%。通過對降解產物的研究表明，該菌中的某些物質具有水解DON的作用，初步確定為環氧化物水解酶。本研究通過基因定位的方法在NJA-1菌中找到含有環氧化物水解酶的基因片段或降解質粒，並對該片段或質粒進行克隆，在大腸桿菌質粒中進行表達；研究不同溫度，時間、pH和金屬離子對酶活的影響；最佳化該酶的發酵條件；測定該酶對飼料中DON毒素的脫毒效果。對該酶的研究將對飼料中DON的生物脫毒提供一種新的解決途徑。
結題摘要
通過提取NJA-1菌中的總RNA，用RT-PCR的方法，獲得了NJA-1菌中DON降解酶的基因片段，構建原核表達載體pET-EHse和酵母表達載體pPIC9K-EHsq。通過誘導，表達了可溶性的EH蛋白。IPTG誘導pET-EHse/BL21的最佳條件為：IPTG終濃度為0.4 mol•L-1，25 ℃，培養16 h，EH的量可達2.3g•L-1菌液。EH的最適pH值為7.0，在pH 6.5～7.5範圍內酶較穩定；最適反應溫度為35 ℃，且在4 ℃～30 ℃範圍內有較好的熱穩定性；有機溶劑乙腈對酶活具有促進作用；Cu2+可以顯著地促進酶活，可以作為該酶的激活劑，Mn2+也可促進酶活。EH產酶的最適培養基組成為：葡萄糖 10 g•L-1；玉米漿15 g•L-1；KH2PO4 1 g•L-1 ；MgSO4.7H2O 0.5 g•L-1；KCl 0.5 g•L-1。通過體外降解試驗證明EH對PBS 溶液中DON的降解效率為 73.42% ~91.83%。在飼料中添加10 mg•kg-1 採用殼聚糖和海藻酸鈉包被的EH能明顯減輕由5mg•kg-1 DON造成的對小鼠的危害，包括生長性能、胸腺和脾臟重量、、血常規、血清生化指標、組織器官病理的變化，與DON組比較差異顯著（p <0.05），而與對照組相比較差異不顯著（p >0.05）。
