基本介紹
- 中文名： 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽
- 外文名：mtt
- 分子式：C18H16BrN5S
- 分子量：414.32
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化學物質
分子式
C18H16BrN5S
分子量
414.32
CAS號
298-93-1
MTT用途及原理
MTT主要有兩個用途：
1．藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養的細胞毒性的測定；
2．細胞增殖及細胞活性測定。
MTT原理：
檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臢（Zā）（Formazan）並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸（DMSO）能溶解細胞中的甲臢（Zā），用酶標儀在490nm波長處（英文說明書寫的是570nm）測定其光吸收值，在一定細胞數範圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值（OD值），來判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小）。
實驗方法
明確問題
1. 選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由於不同細胞貼壁後面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成數量與細胞數呈的線性關係。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。
2. 藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的範圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間範圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。
3. 時間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最後得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什麼時候變得平坦了（到了平台期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現的最明顯）。
4. 培養時間。200ul的培養液對於10的4-5次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨於靜止，影響結果，我們是在48h換液的。
5. MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時，儘量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。
6. 理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。
7. 實驗時應設定調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞碸。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞碸，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物。
8. 避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由於試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小於10%胎牛血清的培養液進行。在呈色後，儘量吸淨培養孔內殘餘培養液。
mtt
mtt步驟把握
MTT溶液的配製方法
通常，此法中的MTT濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶於100 ml的磷酸緩衝液（PBS）或無酚紅的培養基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃避光保存即可。在配製和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。
需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7範圍內。
MTT一般最好現用現配，過濾後4℃避光保存兩周內有效，或配製成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反覆凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。
MTT有致癌性，用的時候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套，配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關係，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作台上的照明燈關掉。
配製MTT時用用PBS溶解，也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。
PBS配方：
Nacl 8g
Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
調pH 7.4
定容1L
貼壁細胞
1. 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。
2. 5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁後即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度，每孔100ul，設3-5個復孔，建議設5個，否則難以反應真實情況。
3. 5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心後棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍後，再加入含MTT的培養液。
5. 終止培養，小心吸去孔內培養液。
6. 每孔加入150ul二甲基亞碸，置搖床上低速振盪0.5min，使結晶物臢（Zā）充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD 560nm處測量各孔的吸光值。
mtt懸浮細胞
1. 收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將：①補足的1640（無血清）培養基40ul；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養液稀釋（儲存液100mg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20）；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100ml 1640）。
2. 置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
3. 每孔加入10ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4h後可跳過步驟4，直接酶聯免疫檢測儀OD 560nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）。
接種（鋪板）
細胞過了30代以後就不要用了，因為狀態不好了；培養板要用好的（最好進口板），不好的板或重複利用的板只可做預實驗。
接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種，因為細胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現的線性關係最好，結果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯，太密細胞可能都會凋亡，因為細胞長的太快營養會不夠，最後導致死亡。且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關係不佳。故而MTT細胞密度多採用10000/ml，100ul/孔。
細胞密度要根據不同細胞的特點來定。如果你做的藥品對細胞具有刺激作用那么取小點的細胞濃度，如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點的細胞濃度，這樣與對照的區別更明顯，數據更好。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105，貼壁細胞可為103-104。
其它的聲音
1. 首先細胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個左右就夠了，我認為寧少勿多。尤其是對於腫瘤細胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現不出的，最佳點板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。（對於不同的細胞，每孔細胞數要摸索一下，對照組OD在1.4以下為佳，當然通常來說更不要超過2。）
2. MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手，20%的波動也是常見的，所以很可能是技術原因引起的，特別是種板技術一定要過關。
3. 我做的是腫瘤細胞的MTT實驗，這種細胞長的很快一開始我是用100000/ML的濃度來接種的，結果細胞長的太滿結果是沒有梯度也沒有線性關係。後來調整濃度，用過40000~80000/ML的濃度都做過MTT實驗，結果發現做的結果比較好點的是60000~70000/ML的濃度組的。用40000/M的濃度的組，由於細胞少，藥物作用的梯度還是有，只是沒有很好的線性關係。還有根據細胞生長速度以及藥物的特性（有時間依賴性和濃度依賴性的藥物）來確定培養時間是48小時還是72小時。
注意細胞懸液一定要混勻，以避免細胞沉澱下來，導致每孔中的細胞數量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，儘量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。另外，吹散次數過多也會影響細胞活力。所以要熟練些、快些上板。
