基本介紹
- 中文名:MTT法
- 外文名:MTT assay
- 學科:生命科學
- 別稱:MTT比色法
簡介,配製方法,實驗步驟,貼壁細胞,懸浮細胞,缺點,注意事項,
簡介
MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法。MTT為黃色化合物,是一種接受氫離子的染料,可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈,在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下,外源性MT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚( Formazan)並沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞碸(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚,用酶聯免疫檢測儀在570nm(參比波長630m)波長處測定其光吸收值,可間接反映活細胞數量。在一定細胞數範圍內,MT結晶形成的量與活細胞數成正比。
配製方法
通常,此法中的MTT濃度為5mg/ml。因此,可以稱取MTT 0.5克,溶於100 ml的磷酸緩衝液(PBS)或無酚紅的培養基中,用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌,放4℃ 避光保存即可。在配製和保存的過程中,容器最好用鋁箔紙包住。
實驗步驟
貼壁細胞
2.、5%CO2,37℃孵育,至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上,細胞貼壁後即可加藥,或兩小時,或半天時間,但我們常在前一天下午鋪板,次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個,否則難以反應真實情況
3.、5%CO2,37℃孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。
5、終止培養,小心吸去孔內培養液。
懸浮細胞
1、收集對數期細胞,調節細胞懸液濃度1×106/ml,按次序將①補足的1640(無血清)培養基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培養液稀釋 lg/ml,需預試尋找最佳稀釋度,1:10-1:20);③需檢測物10ul;④細胞懸液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設對照(加100(儲存液100 1640)。
2、置37℃,5%CO2孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4 h。(懸浮細胞推薦使用WST-1,培養4 h後可跳過步驟4),直接酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值)
缺點
注意事項
MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力,但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候,為了保證實驗結果的線性,MTT 吸光度最好在0-0.7 範圍內。
MTT一般最好現用現配,過濾後4℃避光保存兩周內有效,或配製成5mg/ml保存在-20℃長期保存,避免反覆凍融,最好小劑量分裝,用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里,用的時候現配,直接往培養板中加,沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。
PBS配方:
Nacl 8g
Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
調pH 7.4
定容1L