《J亞群禽白血病病毒受體的鑑定及特性研究》是依託揚州大學，由梅梅擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：J亞群禽白血病病毒受體的鑑定及特性研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：梅梅
- 依託單位：揚州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
J亞群禽白血病（ALV-J）不同於其他亞群的病毒，它不但引起肉雞腫瘤，如今在我國還引起蛋雞和地方品種雞的腫瘤。儘管2006年國外鑑定出一種ALV-J受體NHE1，然而是否還存在其他的ALV-J受體？ALV-J如何啟動感染？病毒進入細胞後的下游途徑是什麼？這些問題都不明確。所以本項目擬通過真核系統表達ALV-J env蛋白SU亞單位和兔IgGFc的融合蛋白，利用融合蛋白通過免疫共沉澱技術（CO-IP）捕捉易感細胞中ALV-J受體並進行質譜分析；PCR擴增可疑受體基因並在ALV-J非易感細胞中表達、重建受體蛋白，進一步通過免疫共沉澱試驗和病毒感染試驗鑑定受體的特異性和介導病毒感染的功能。研究結果將有助於揭示宿主細胞與病毒囊膜蛋白相互作用關係和致病機制。
結題摘要
J亞群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J, ALV-J )是1980年代從肉雞中首次分離鑑定。到目前為止，禽白血病病毒受體分離鑑定研究中，已有四種受體蛋白得到鑑定，分別是Tva, Tvb，Tvc和chNHE1。反轉錄病毒中被鑑定的病毒受體已有很多，如人免疫缺陷病毒利用CD4、CCR5和CXCR4分別作為主要受體和共受體感染人CD4 T細胞，較多的反轉錄病毒廣泛地使用各種共受體分子介導病毒感染，這些病毒受體的鑑定為深入研究病毒感染機制和為人類控制疾病發揮了很好的作用。 本研究利用J亞群禽白血病病毒為模型，通過免疫共沉澱、質譜分析、螢光定量PCR等技術進行了ALV-J新受體的分離鑑定和特性分析。首先在腺病毒系統中成功表達了用於捕獲病毒受體的誘餌蛋白，為下一步分離ALV-J受體提供了重要的物質基礎。 同時利用DF1細胞和pcDNA-env DF1細胞系作為受體供體細胞，採用兩種方案進行免疫共沉澱試驗，SDS-PAGE和銀染、切膠、質譜分析。經質譜測序獲得兩種膜蛋白，分別是78kd葡萄糖調節蛋白（GRP78）和 膜聯蛋白A2（ANXA2），提示ANXA2和GRP78是ALV-J疑似受體。 為進一步鑑定ANXA2和GRP78，採用病毒感染抑制試驗和RNA干擾鑑定GRP78和ANXA2對J亞群禽白血病病毒粒子進入靶細胞或在早期感染過程中是否發揮著受體的功能。通過IFA、WB、real-time PCR 、TCID50分別檢測細胞中ALV-J env的表達水平，判定病毒感染抑制效果。結果顯示，隨著阻斷抗體濃度的加大，DF1細胞中env蛋白越來越少，病毒滴度也顯著降低，而對ALV-A的感染無任何抑制作用；RNAi試驗結果與感染抑制試驗結果一致。表明，GRP78和/或ANXA2的缺失導致ALV-J感染率的急劇下降甚至感染失敗，表明GRP78和ANXA2是ALV-J的受體或共受體。 最後，本研究利用人胚腎細胞（HEK293T細胞）和鵝胚成纖維細胞（GEF）作為受體重建靶細胞，檢測chGRP78和chANXA2是否具有介導ALV-J進入非易感細胞的功能。Real-time PCR結果顯示，共表達chGRP78或chANXA2的293T細胞內env基因的相對表達水平相對空載體轉染的293T細胞要高得多，說明ALV-J病毒粒子能夠藉助293T細胞表面
