《Hsp16.3通過JNK/p38信號通路調控自噬的發生參與MTB潛伏感染的形成》是依託中國人民解放軍第四軍醫大學，由張彩勤擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：Hsp16.3通過JNK/p38信號通路調控自噬的發生參與MTB潛伏感染的形成
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：張彩勤
- 依託單位：中國人民解放軍第四軍醫大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
巨噬細胞自噬功能減弱是MTB潛伏感染（LTBI）形成的機制之一。已有文獻證實在潛伏感染中MTB菌體蛋白能夠通過誘導活性氧自由基（ROS）的產生影響自噬的發生，而連線ROS和自噬的信號分子主要是JNK。預實驗發現MTB菌體蛋白Hsp16.3能夠影響巨噬細胞的自噬，提示Hsp16.3可能通過JNK/p38信號通路調控LTBI中自噬的發生，促進MTB在細胞記憶體活。本研究擬使用MTB野生株和Hsp16.3基因缺失株分別感染小鼠和人的巨噬細胞，觀察巨噬細胞自噬功能的變化；通過Western-blot、雷射共聚焦和siRNA技術測定巨噬細胞中自噬相關分子PI3P和TLRs、以及ROS依賴的JNK/p38信號分子的變化；通過製備小鼠LTBI模型，進一步明確Hsp16.3對模型鼠腹腔巨噬細胞自噬相關通路JNK/p38的影響。解析在LTBI中Hsp16.3對自噬的調控作用，探索LTBI免疫逃逸的分子機制。
結題摘要
結核病（tuberculosis，TB）高發病率和死亡率的主要原因之一是大量處於潛伏感染狀態的人群活化成為活動性結核病。休眠菌可在宿主細胞內持續存在，不引起機體任何症狀和表征，但在一定條件下能重新複製從而使機體致病。有實驗表明，敲除Hsp16.3蛋白的結核分枝桿菌在骨髓巨噬細胞以及THP-1 細胞中難以進入休眠狀態。表明了Hsp16.3與MTB 潛伏感染密切相關，在MTB 進入休眠狀態而持續存活的過程中起著重要作用。 構建陽性重組質粒pKO-Hsp16.3，根據同源重組的原理和基因敲除技術，將陽性重組質粒pKO-Hsp16.3 電轉入 BCG 和毒株 H37Rv 的感受態細胞中，經過硫酸卡那黴素和蔗糖兩次篩選，分別獲得BCG和H37Rv 菌株的Hsp16.3 基因突變株。將構建的卡介苗和H37Rv 的Hsp16.3基因缺失株作用於小鼠巨噬細胞Raw264.7，主要通過透射電鏡和雷射共聚焦顯微鏡觀察自噬體的形成和LC3點狀聚集物的形成，結果發現MTB的Hsp16.3 基因突變株作用巨噬細胞後，LC3點狀聚集物明顯增多，自噬體形成數量明顯增加，表明MTB的Hsp16.3 基因突變株能促進小鼠巨噬細胞Raw264.7的自噬；通過Western Blot 技術分析自噬相關分子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1等表達水平的變化，結果顯示LC3II的表達顯著增加，LC3-Ⅰ和BeclinⅠ的表達呈現下降趨勢；然後分別觀察小鼠巨噬細胞RAW264.7吞噬的卡介苗和H37Rv 的Hsp16.3基因缺失株菌體的形態和CFU計數，發現感染MTB基因缺失株的巨噬細胞中吞噬的MTB菌體較少，結果表明抑制Hsp16.3蛋白的表達後能促進巨噬細胞發生自噬，促使更多的MTB在自噬中被清除。綜上實驗結果表明，結核分枝桿菌中的分泌蛋白Hsp16.3在MTB發生休眠的過程中，充分發揮了抑制自噬發生的作用，促使了胞內MTB的存活，從而促進了結核分枝桿菌潛伏感染（LTBI）的發生。 研究Hsp16.3在巨噬細胞感染MTB過程中調控自噬發生的機制，對闡明結核分枝桿菌潛伏感染形成的機制提供一定的理論依據。期望Hsp16.3可作為活動性結核病和LTBI患者診斷的輔助指標，並對高危患者的結核病篩查和早期診斷具有重要意義，從而為結核病的防控提供有意義的參考。
