《GlnR 在類芽孢桿菌固氮基因表達中的調控作用》是依託中國農業大學，由陳三鳳擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：GlnR 在類芽孢桿菌固氮基因表達中的調控作用
- 依託單位：中國農業大學
- 項目負責人：陳三鳳
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
固氮類芽孢桿菌（Paenibacillus）抗逆力強和存活期長，是製備生物肥料的最佳菌種。與其它固氮菌類似，固氮類芽孢桿菌的固氮效率受銨調控，但其固氮調節機理尚不清楚。最近我室研究發現，類芽孢桿菌的的固氮基因（nif）啟動子屬於σ70型，啟動子內有GlnR蛋白結合位點，不同於大多數nif啟動子屬於σ54型，其轉錄嚴格依賴NifA蛋白。本項目研究目標是確定 GlnR根據銨濃度調控nif及氮代謝基因的表達。研究內容主要是：1、凝膠阻滯和Footprinting確定GlnR蛋白與nif啟動子結合；2、ΔglnR 突變株構建；3、利用qRT-PCR研究在高銨和低銨條件下，野生型類芽孢桿菌和ΔglnR株中nif基因的表達；4、染色質免疫沉澱技術研究體內GlnR與哪些基因啟動子結合；5、全基因組轉錄分析確定哪些基因受GlnR調控;6、研究異源大腸桿菌中，GlnR對nif基因的調控作用。
結題摘要
1. 項目研究背景 固氮微生物在常溫常壓下,利用體內的固氮酶能將空氣中的氮氣還原成銨，供植物生長利用。但固氮效率受銨濃度的影響，即，在無銨或銨濃度低時固氮，銨濃度一般大於5 mM以上抑制固氮。在貧瘠的土壤里，固氮微生物的固氮效率高，而在肥沃的土壤里，只生長但不固氮。因此，闡明固氮調控機理，獲得在高銨條件下固氮的微生物，在農業生 產中具有重要的套用價值。 2. 主要研究內容 （1）glnR基因的克隆和在大腸桿菌中的表達；（2）凝膠阻滯（EMSA）和 Footprinting 確定GlnR 與固氮基因啟動子的結合；（3）GlnR 蛋白在異源大腸桿菌中對 nif 基因轉錄和活性的影響；（4）ΔglnR 突變株的構建；（5）ΔglnR 突變株中固氮基因的表達；(6) 利用染色質免疫沉澱技術（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）研究在固氮類芽孢桿菌體內GlnR蛋白質與哪些基因的啟動子DNA結合。 3. 重要結果通過基因突變、凝膠阻滯（EMSA）、表面電漿（SPR）、免疫共沉澱（ChIP）等研究表明，在固氮類芽孢桿菌中，氮代謝總調控因子GlnR和GS（谷氨醯胺合成酶）調控固氮基因的表達。我們的研究率先揭示出了一個全新的固氮調控機理。在固氮基因簇（nifBHDLENXhesAnifV）上游的啟動子區，有兩個GlnR結合位點，分別位於啟動子-35/-10區上下游。在無銨條件下，GlnR與上游位點結合激活固氮基因表達；在高銨條件下，GlnR與下游位點結合抑制固氮基因表達。谷氨醯胺是氮的信號傳遞者。銨濃度高時，GS催化銨和谷氨酸合成谷氨醯胺，谷氨醯胺反饋抑制GS、並與GS相互作用形成反饋抑制型谷氨醯胺合成酶（FBI-GS），FBI-GS參與GlnR抑制固氮基因轉錄。這是首次闡明固氮類芽孢桿菌中獨特的固氮調控機理。同時，對拓展研究GlnR同時具有激活和抑制調控作用也具有重要的意義，因為在枯草芽孢桿菌等陽性細菌中，GlnR被認為在氮代謝中只起抑制作用。另外，該研究表明，對編碼GS的glnA基因缺失、對編碼GlnR的glnR基因增加拷貝數及對GlnR的第2個結合位點進行突變，都能使固氮微生物在有銨（0-400 mM）條件下固氮，在農業生產中具有重要的套用價值。
