《GFAT在乳酸菌中作為新型生物安全性篩選標記的研究》是依託東南大學，由武國乾擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：GFAT在乳酸菌中作為新型生物安全性篩選標記的研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：武國乾
- 依託單位：東南大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
隨著對生存環境，人類健康，食品及轉基因作物的安全性等問題的日益關注，基因工程中所用選擇標記基因的生物安全性成為研究熱點。谷氨醯胺：6-磷酸果糖氨基轉移酶(GFAT)是己糖胺途徑中的第一步限速酶，本項目通過構建L. lactis NZ9700的glms基因缺陷型菌株L. lactis NZ9700m確定L. lactis glms基因的必需性，將來源於L. lactis MG1363的glms基因作為篩選標記基因源。以來自於短乳桿菌的乳酸脫氫酶作為報告基因，nisA啟動子調控glms基因的表達，通過乳酸脫氫酶基因的表達評價glms基因作為篩選標記的功能。保守酶基因glms作為篩選標記基因具有極高的生物安全性，且不同於以往傳統代謝途徑來源的選擇標記基因，具有基因工程操作便捷，成本低廉，篩選方便，不受培養基成分限制等優勢，為食品微生物的基因工程提供新的重要手段。
結題摘要
谷氨醯胺：6-磷酸果糖氨基轉移酶，也即6-磷酸葡萄糖胺合成酶(Glms)是己糖胺途徑中的第一步限速酶，本項目通過雙交換敲除了L. lactis NZ9700 的glms 基因，並引入Cre-loxP系統去除基因組上的紅黴素抗性標記基因，得到glms 基因缺陷型菌株L. lactis NZ9700g，該菌株在不加葡萄糖胺的情況下不能存活，表明該基因對L. lactis來說是個必需基因，L. lactis NZ9700g在添加1 mM葡萄糖胺的M17培養基中生長良好與L. lactis NZ9700生長接近。反向PCR去除載體pNZ8030上的Cm抗性基因，將來源於L. lactis MG1363 的glms 基因片段與去除了Cm抗性表達盒的片段連線後得到重組質粒pNZ8030g，轉化進L. lactis NZ9700g進行表達， glms 基因即作為篩選標記基因，在不加葡萄糖胺的情況下，L. lactis NZ9700g能夠正常生長。將來源於L. lactis NZ9700的乳酸脫氫酶基因ldh的組成型啟動子與glms 基因克隆進pNZ8030載體的Cm抗性基因位置，經此改造得到以glms 基因作為篩選標記基因的表達載體pNZ8030PLg。
