GABABR介導小分子G蛋白Rap1激活的分子機制研究

《GABABR介導小分子G蛋白Rap1激活的分子機制研究》是依託華中科技大學，由蘇莉擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：GABABR介導小分子G蛋白Rap1激活的分子機制研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：蘇莉
• 依託單位：華中科技大學

中文摘要

Rap1是小分子G蛋白Ras家族成員之一，在細胞增殖、分化、粘附和神經突觸生長等方面起重要調節作用。代謝型γ-氨基丁酸跨膜受體（GABABR）是C族GPCRs的重要成員，通過與G蛋白偶聯，介導神經系統中多種細胞應答和生理過程。我們在小鼠小腦顆粒神經元中發現GABABR激活後可誘導Rap1持續激活，並且發現Ca2+信號參與了此激活過程。本項目將在此基礎上，利用Rap1GTP活性檢測技術和膜片鉗光電測量系統，結合逆轉錄病毒轉染和RNAi干擾技術，對GABABR介導Rap1持續激活的分子機制進行深入而細緻的研究，闡明GABABR/Rap1新信號通路，為以此通路為靶點的藥物研發提供理論依據。並且擬利用活細胞高速雷射共聚焦顯微鏡及全內反射多維圖像工作站，探討激活的GABABR對Rap1分子在細胞內定位的影響，為深入研究Rap1蛋白與GABABR跨膜蛋白間的相互作用機制及其生理意義打下基礎。

結題摘要

GABAB受體屬於G蛋白偶聯受體C家族成員之一，是抑制性神經遞質GABA的代謝性受體，介導緩慢而且持久的神經突觸活動。Rap1是一種可以再活性與非活性間互相轉換的小G蛋白分子，在細胞增殖、遷移、粘附、神經突觸生長等生理功能中均發揮重要作用。在本研究中，我們首先利用表達GABAB受體C末端的融合蛋白GST-GB1-C或GST-GB2-C作為誘餌，在體外培養的小腦顆粒神經元細胞中，找尋結合到GABAB受體C末端的新的蛋白。通過銀染，質譜分析，免疫印跡實驗發現Ras家族成員的小G蛋白Rap1特異性的結合到GABAB受體GB1亞基的C末端，而且只有活性的Rap1GTP才能直接結合GB1亞基C末端，但不結合GB2亞基的C末端。同時我們證明了GABAB受體的激活會特異性的介導持續性的長時間的Rap1激活，受體激活Rap1是通過Gi/o信號的αlpha亞基通路傳遞的，而且Rap1GAPII參與這一過程。進一步我們證明了GABAB受體的激活會導致Rap1從細胞質區域遷移到細胞膜區域，突變體依賴的GST Pull-down實驗和化學合成短肽實驗證明了活性Rap1結合在GABAB受體的GB1亞基的C末端胺基酸954-960區域（RVHLLYK），其中帶正電荷的胺基酸R954和K960分別與活性Rap1效應子(effector)結合區域中帶負電荷的D33和E37有靜電作用。接下來我們發現短肽Pep (DGSRVHLLYK)可以在細胞內特異性的阻斷活性Rap1與GB1亞基的C末端相互作用，表現出減少GABAB受體介導的IP3積累。同時我們發現了短肽Pep阻斷活性Rap1與GB1亞基的C末端相互作用後，會導致GABAB受體在細胞膜上的數目減少，過表達Rap1GAPII也會降低GABAB受體在細胞膜上的數目。利用缺失結合Rap1區域的ΔS953-GB1研究發現，配體激活ΔS953-GB1後，直接導致ΔS953-GB1在細胞膜上的數目減少,然而配體並不減少野生型GB1亞基在膜表面的數目。我們發現GABAB受體的激活會導致持續性的Rap1激活，而且活性的Rap1會結合到GABAB受體的GB1亞基的胞內區C末端，從而起到控制GABAB受體在細胞膜表面活性穩定的作用。這表明GABAB受體介導的Rap1激活對於GABAB受體自身而言是一種正反饋調控機制。