《DNA複製起始蛋白Mcm6-Cdt1相互作用的結構與功能研究》是魏準為項目負責人，北京大學為依託單位的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：DNA複製起始蛋白Mcm6-Cdt1相互作用的結構與功能研究
- 項目類別 ：青年科學基金項目
- 依託單位 ：北京大學
- 項目負責人：魏準
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
DNA複製起始受複製前複合物(pre-RC)的嚴格控制。微小染色體維持蛋白 (MCM) 複合物是pre-RC的重要組分，由 Mcm2-Mcm7六個亞單位組成，被認為是DNA複製過程中的解鏈酶並在複製叉的延伸過程中發揮關鍵作用。在細胞周期的M晚期和G1早期，Mcm2-7複合物依賴於pre-RC的另一個重要亞單位Cdt1而結合於染色質,但其作用方式仍然未知。目前，已確認的Cdt1與Mcm2-7亞單位的相互作用限於Mcm6-Cdt1。申請人發現Mcm6羧基末端能夠與Cdt1相互作用,並發表其空間結構，目前已解析Mcm6-Cdt1相互作用結構域的複合物結構。本項目計畫利用結構學研究得到的信息，體外組裝爪蟾Mcm2-7複合物，在爪蟾卵提取物中研究Mcm6-Cdt1相互作用對於pre-RC的裝配是否具有決定性意義以及對DNA複製的影響，有望闡明Cdt1引導Mcm2-7複合物結合於染色質的分子機理。
結題摘要
DNA複製是生命科學領域的研究重點和熱點，該過程是一個非常複雜的酶學過程，需要多種酶和蛋白質協同作用，DNA複製起始階段是DNA複製的關鍵過程，需要多種蛋白以及蛋白複合物準確的在複製原點裝配。在Cdt1的作用之下，Mcm2-7複合物裝配於染色質，從而完成pre-RC的裝配，標誌著DNA複製起始階段的完成。Mcm2-7複合物是由六個蛋白組成的複合體，其分子量巨大，結構複雜，在DNA複製過程中起解鏈酶的作用。Cdt1採取何種方式把如此巨大的複合物導向染色質在分子機理層面仍然沒有被闡明。鑒於Mcm6-Cdt1之間存在較強的相互作用，研究其相互作用將有助於揭示Mcm2-7複合物如何裝配於染色質，從而起始DNA的複製有重要意義。 本項目從研究蛋白-蛋白相互作用入手，在前期的工作基礎上，通過構建一系列突變體並選取爪蟾卵提取物研究Cdt1與Mcm2-7各亞單位之間的相互作用以及Mcm6-Cdt1相互作用對Mcm2-7複合物裝配到染色質上的影響，擬解決以下科學問題： 1. 在Mcm2-7複合物當中，Cdt1是否只能與Mcm6存在顯著的相互作用以及證明Mcm2是否與Cdt1有相互作用。 2. 研究如果打斷Cdt1與Mcm6的相互作用，是否影響Cdt1與Mcm2-7複合物形成更大的複合物。從而在一定層面證明Mcm6-Cdt1相互作用的重要性。 3. 儘管Cdt1與Mcm6存在較強的相互作用，但是該作用的生物學意義至今仍然沒有被報導。我們推斷該相互作用將引導Mcm2-7複合物結合在染色質上面，從而完成pre-RC的組裝，為基因組DNA的複製做好準備。本項目的研究結果將驗證該假想的正確性，闡明Cdt1與Mcm6相互作用的意義。 針對擬解決的科學問題，科學設計相應的實驗路線，取得主要研究成果如下: 1. 發現Cdt1上面參與Cdt1-Mcm6相互作用的胺基酸，證明Cdt1與除Mcm6之外的Mcm2-7複合物各亞單位沒有直接的相互作用。 2. 證明Cdt1以及Mcm6上面參與兩者相互作用的關鍵胺基酸的突變,會影響Cdt1與Mcm2-7複合物形成更大的複合物。 3. 通過分別構建Cdt1以及Mcm6的突變體，證明打斷Cdt1-Mcm6之間的相互作用，導致Mcm2-7複合物無法結合於染色質，從而影響pre-RC的形成。
