DNA甲基化修飾調控紅豆杉細胞中紫杉醇合成的機理研究

《DNA甲基化修飾調控紅豆杉細胞中紫杉醇合成的機理研究》是依託華中科技大學，由付春華擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：DNA甲基化修飾調控紅豆杉細胞中紫杉醇合成的機理研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：付春華
• 依託單位：華中科技大學

項目摘要

植物細胞培養過程中次生代謝產物產量不穩定，是制約其產業化的瓶頸。前期研究表明，紅豆杉細胞培養過程中紫杉醇合成與DNA甲基化水平呈顯著負相關。本研究擬以不同培養代數、去甲基化試劑處理的紅豆杉細胞係為試材，採用雙向電泳-質譜技術分離並鑑定差異表達蛋白，利用RT-PCR及 Ms-SnuPE定量分析差異表達蛋白在培養過程中的表達水平及甲基化水平，進而明析紅豆杉細胞培養過程中與紫杉醇生物合成有關的蛋白譜，篩選與紫杉醇生物合成下降相關的甲基化失活基因。項目實施後，一方面可解析DNA甲基化調控紅豆杉離體培養細胞中紫杉醇生物合成的機制，豐富人們對真核生物基因表達調控的認識；另一方面有助於揭示紅豆杉細胞培養過程中次生代謝物含量下降機制，為高產細胞系的合理利用及尋找相關調控措施，建立細胞系穩定傳代的方法工藝提供理論依據。項目的完成對於其它藥用植物利用細胞大規模培養穩定生產次生代謝產物有很好的指導意義。

結題摘要

植物細胞培養過程中次生代謝產物產量不穩定，是制約其產業化的“瓶頸”。前期研究表明，紅豆杉細胞培養過程中紫杉醇產量下降與DNA甲基化水平升高呈顯著負相關。本研究以去甲基化試劑5-aza-2-dC處理的紅豆杉細胞係為試材，採用雙向電泳-質譜技術分離並鑑定差異表達蛋白，為篩選與紫杉醇生物合成下降相關的甲基化失活基因打下基礎。經過3年多的研究，基本完成了實驗任務，在一定程度上闡明了DNA甲基化調控紅豆杉細胞中紫杉醇生物合成機理。具體結果如下： 建立了紅豆杉細胞總蛋白提取及雙向電泳技術，對去甲基化試劑處理前後的樣品進行雙向電泳檢測，共找到121個表達差異在1.5倍以上的點，其中上調48個，下調73個。選取其中差異比較大的80個點進行質譜鑑定，62個蛋白點有峰圖，其中有29個能與資料庫中的蛋白比對上，還有33個蛋白點是在資料庫中未找到的新蛋白。鑑定出的蛋白按照功能類型可分為8類：細胞防禦蛋白類、碳水化合物代謝相關蛋白、能量代謝、脂代謝、細胞生長和死亡、轉運和分解、調控蛋白和未知功能蛋白。結合轉錄組資料庫信息，克隆了其中7個差異表達蛋白的cDNA序列，定量PCR分析表明，有5個基因表達趨勢與蛋白組結果一致，2個基因不一致，表明去甲基化處理也可以在翻譯水平影響蛋白的表達量。克隆了紫杉醇合成相關基因GGPP、T5aH、T10bH、TS、T13aH、DBAT、DBTNBT基因啟動子，生物信息學分析發現，TS、T13aH、DBAT、DBTNBT基因啟動子序列上有潛在的甲基化發生位點，GGPP、T5aH、 T10bH基因啟動子序列上無潛在的甲基化發生位點，說明發生DNA甲基化的可能是紫杉醇合成相關酶。另外，發現去甲基化試劑對DNA甲基轉移酶的作用具有選擇性，利用RNAi技術干涉DNA甲基轉移酶基因的表達可提高紅豆杉細胞中紫杉醇的含量。從以上結果可以看出，DNA甲基化調控紫杉醇合成機理複雜，涉及到初生代謝、次生代謝、信號轉導等複雜的生物過程，紅豆杉細胞長期繼代過程中發生甲基化的基因可能是紫杉醇合成相關基因，也可能是某些調控基因。 已發表論文5篇，其中SCI論文3篇，有2篇SCI論文正在審稿中。