CVTK試劑

CVTK細胞增殖與毒性檢測試劑盒（全稱Cell Vitality Test Kit ）(原名CCK-8)為MTT法的替代方法，是銳賽生物公司研發的一種基於WST-8的廣泛套用於細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。

基本介紹

• 中文名：CVTK試劑
• 外文名：Cell Vitality Test Kit
• 原名：CCK-8
• 研發公司：銳賽生物公司

檢測原理

WST-8是一種類似於MTT的化合物，在電子耦合試劑1-Methoxy PMS存在的情況下，可以被還原生成橙黃色水溶性的甲臢（Formazan） (圖1)。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對於同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目呈線性關係。

試劑用途

可用於細胞增殖檢測、細胞毒性檢測、藥物篩選、腫瘤藥敏試驗等。

CVTK試劑提供了一種靈敏度高、操作簡便、使用安全的細胞增殖與毒性檢測方法。與傳統的MTT法相比具有明顯的優勢：

1、即開即用，無需預配，無需放射性同位素和有機溶劑；

2、實驗步驟少，操作簡單，省時省力；

3、產物水溶性，無需換液，尤其適合於懸浮細胞；

4、靈敏度高，數據可靠，重複性好；

5、對細胞毒性低，可多次測定選取最佳測定時間，線性範圍更寬；

6、適合高通量藥物篩選；

使用方法

1. 在96孔板中接種細胞懸液 (100 ul /孔 )，通常細胞增殖實驗每孔約2000個細胞，細胞毒性實驗每孔約5000個細胞。具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小、細胞增殖速度的快慢等因素調整。

2. 若進行細胞毒性實驗，按照實驗需要培養並給予0-10ul特定的藥物刺激，處理一段適當的時間。若進行細胞增殖實驗，則跳過此步，直接加入CVTK進行檢測。

3. 每孔加入10ul CVTK溶液。如果起始的培養體積為200ul，則需加入20ul CVTK溶液，以此類推。可以用加相應量細胞培養基和CVTK但不加細胞的孔作為空白對照，若擔心所使用的藥物會干擾檢測，需設定加相應量細胞培養液、藥物和CVTK溶液但不加細胞的孔作為空白對照。

4. 在細胞培養箱內繼續孵育1-4小時，具體時間可以通過預實驗確定。預實驗時可以在0.5、1、2和4小時後分別用酶標儀檢測，然後選取吸光度範圍適宜的一個時間點用於後續實驗。

5. 用酶標儀測定在450 nm處的吸光度，若無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。如果樣品為高渾濁度的細胞懸液，可以使用大於600nm的波長，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定。

6. 如果需要暫時不測定O.D值，可以向每孔中加入10ul 0.1M HCl溶液或者1% w/v的SDS溶液，室溫下避光保存，24小時內吸光度不會發生變化。

注意事項

1. 使用96孔板進行檢測時，如果細胞培養時間較長，請注意蒸發問題。可將96孔板外圍一圈加培養基、水或PBS保濕。同時，可以把96孔板置於培養箱內靠近水盤的位置以緩解蒸發。

2. 鋪板時請注意保證每個孔細胞數量均勻，建議鋪板過程中注意時常混勻，防止因細胞沉澱造成不均勻。

3. 培養時間根據細胞種類的不同和每孔內細胞數量的多少而不同。在正式實驗前，建議先做預實驗摸索鋪板的細胞數量以及加入CVTK試劑後的培養時間。

4. 本試劑盒的檢測依賴於脫氫酶催化的反應，如果待測物質有氧化性或還原性，可在加CVTK之前更換新鮮培養基，去掉藥物的影響。若藥物影響比較小的情況可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物後的空白吸收即可。

5. 加入CVTK後請前後左右輕輕晃動培養板數次，使培養基和CVTK充分混勻。

6. 加入CVTK時，如果細胞培養時間較長，培養基顏色或pH值已變化，建議換用新鮮的培養基。

7. 用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定。