CRISPR系統對志賀菌耐藥與毒力的調控機制研究

《CRISPR系統對志賀菌耐藥與毒力的調控機制研究》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由宋宏彬擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：CRISPR系統對志賀菌耐藥與毒力的調控機制研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：宋宏彬
• 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院

中文摘要

志賀菌近年來呈現多耐藥、高毒力特點，嚴重危害人類健康。CRISPR(成簇的規律間隔短回文重複序列)是新發現的原核生物獲得性免疫系統，具有調控細菌耐藥和毒力的重要作用，但具體的作用機制不清楚。本課題以福氏和宋內兩種國內主要流行志賀菌為研究對象，利用生物信息學和分子生物學等技術，分析志賀菌不同耐藥程度、不同毒力強度菌株間CRISPR系統的差異，確定志賀菌CRISPR系統間區與其耐藥/毒力基因的同源性關係，研究CRISPR系統與志賀菌不同耐藥程度、不同毒力強度菌株間可否接合轉移的關係；闡明CRISPR系統對志賀菌通過接合轉移等水平基因轉移獲得耐藥/毒力的調控作用途徑，最終明確CRISPR系統對志賀菌耐藥和毒力的共調解機制。本課題屬首次研究CRISPR系統對志賀菌耐藥和毒力的調控機制，為有效防控多耐藥高致病性細菌的傳播和流行提供技術支持。

結題摘要

志賀菌（Shigella spp.）是一類引起細菌性痢疾的重要腸道致病菌，成簇規律的短回文重複序列（CRISPR）是細菌中的一種獲得性免疫系統，主要結構包括重複序列、間隔序列以及Cas蛋白基因序列。已有的研究表明CRISPR在細菌的毒力、耐藥以及代謝等方面也發揮了重要的調控作用。我們對志賀菌中CRISPR系統的遺傳多態性進行了研究，通過對246株不同型別志賀菌中五個CRISPR位點篩選與測序，全面掌握了志賀菌各群及亞型中的CRISPR位點的存在性及多態性，發現了志賀菌中存在的20條間隔序列，將此間隔序列與志賀菌染色體序列、質粒序列與噬菌體序列資料庫進行同源性比對，結果顯示共有4條間隔序列與stx2（Shiga toxin 2，志賀毒素2）溶原性噬菌體存在同源性片段，表明志賀菌CRISPR在控制stx溶原性噬菌體在菌株間的轉移過程中發揮了功能，從而調控志賀菌毒力的傳播。通過比對發現志賀菌CRd位點存在I-E型Cas蛋白基因序列，隨後對20株志賀菌的Cas蛋白序列篩查，發現與正常的I-E型CRISPR相關蛋白序列相比，宋內志賀菌的CAS蛋白序列中存在兩段插入序列IS600及ISffl2。採用無痕敲除的方法，對志賀菌中兩段插入序列及其插入的兩個CAS蛋白進行無痕敲除構建突變株。Biolog生化反應及耐藥性分析結果顯示CRISPR中的插入序列影響了志賀菌對抗生素氨曲南、二甲胺四環素的耐藥性。對恢復了CRISPR完整結構的突變株的耐藥質粒轉化實驗結果顯示，在敲除了插入序列，恢復了Cas蛋白基因簇，並解除了HNS的抑制之後，耐藥質粒轉化的效率明顯降低，說明突變株中的CRISPR系統能夠正常發揮免疫功能，有效的阻止耐藥質粒進入菌體。iTRAQ差異蛋白組學分析結果顯示與志賀菌耐藥相關的strA、gyrA、gyrB等蛋白，以及與志賀菌毒力相關的細菌 I 型分泌系統相關的glnH、potD、yehZ、yrbD、yjgQ蛋白，II 型分泌系統（T2SS）相關的SecA、SecB和FtsY等蛋白均發生了不同程度的下調，說明志賀菌CRISPR系統是通過影響這些蛋白來對其毒力和耐藥性進行共調控作用。本研究還發現志賀菌CRISPR對其代謝與耐酸性也存在調控作用，並基於志賀菌各型別中CRISPR系統的多態性建立了CRISPR位點的分子分型新方法。