《CKIP-1對氟致成骨細胞凋亡的調控作用研究》是依託中國農業大學，由韓博擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：CKIP-1對氟致成骨細胞凋亡的調控作用研究
- 依託單位：中國農業大學
- 項目負責人：韓博
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
近年來，本研究團隊通過分子生物學和細胞生物學方法進行了一系列的氟對成骨細胞（OB）細胞因子表達和OB凋亡的影響研究，具備良好的研究基礎。而CKIP-1因子於近期被證實對成骨細胞凋亡具有正向調控作用。因此本研究旨在通過RNAi技術干擾成骨細胞CKIP-1基因的表達，進行CKIP-1對體外氟致成骨細胞增殖凋亡的調控作用研究。研究內容包括：①建立OB原代培養模型並進行鑑定；②實時螢光定量PCR和Western-blot對氟致OB凋亡過程中CKIP-1基因在 mRNA和蛋白水平的表達；③用MTT法、電鏡技術研究OB凋亡過程中其增殖活力和形態學的變化；④流式細胞術分析OB增殖周期和凋亡的變化；⑤利用電子順磁共振波譜儀測定OB凋亡過程中自由基的變化。通過以上研究，闡明CKIP-1在氟致成骨細胞增殖凋亡過程中發揮的作用，從而為CKIP-1經過干擾表達技術套用於臨床防治氟骨症提供依據。
結題摘要
氟致成骨細胞出現凋亡，CKIP-1基因對成骨細胞凋亡具有正向調控作用。但是，CKIP-1對氟致成骨細胞凋亡的調控機理仍不清楚。本研究旨在通過RT-PCR、Western-blot、電鏡技術和流式細胞儀等研究氟致成骨細胞凋亡過程中CKIP-1基因mRNA和蛋白水平表達；細胞增殖活力和形態改變；凋亡和自由基的變化。結果表明，小鼠CKIP-1基因特異性引物為CKIP-1-1，退火溫度為58℃。CKIP-1的mRNA表達結果顯示，三對siRNA-CKIP-1在沉默CKIP-1 24h和48h後，對CKIP-1mRNA相對表達量極顯著的下降。最佳化Western Blot條件後，NaF對成骨細胞（MC3T3-E1）CKIP-1mRNA基因和蛋白表達的結果顯示：1d，NaF濃度為10-5mol/L時，CKIP-1 mRNA的表達量極顯著高於對照組；2d，各個NaF處理組mRNA的表達量極顯著高於對照組，不同濃度間對mRNA的表達量未見明顯差異。試驗的第1天，10-4、5×10-4、5×10-5和10-5 mol/L組CKIP-1蛋白表達量極顯著高於對照組；2d，10-3-5×10-5 mol/L組蛋白表達量顯著高於對照組；3d和4d，各NaF處理組的蛋白表達量均極顯著高於對照組。即NaF在1d、2d、3d和4d可以引起CKIP-1蛋白表達量的升高，並且在10-4-10-5 mol/L濃度NaF範圍內，CKIP-1蛋白表達量與NaF濃度間沒有顯著的濃度依懶性。SiRNA沉默CKIP-1的沉默效率結果顯示：1d、2d、3d和4d，siRNA沉默CKIP-1的效率分別達到50.9%、96.4%、52.1%和60.5%，其中以第2d的沉默效率最高，即siRNA沉默組CKIP-1 mRNA表達量極顯著低於陰性對照組。沉默CKIP-1後NaF對MC3T3-E1CKIP-1基因表達的結果顯示：對於1d和2d，siRNA沉默CKIP-1效率達到58.1%和58.5%，即對照組的mRNA表達量都極顯著低於陰性對照組；在1d，10-3mol/L濃度NaF處理組mRNA的相對表達量極顯著高於對照組；在2d，10-4mol/L濃度NaF處理組mRNA的相對表達量顯著高於對照組。上述研究表明，CKIP-1在氟致成骨細胞凋亡過程中發揮促進作用，從而為CKIP-1干擾表達技術套用於臨床防治氟骨症提供依據。
