《APOBEC3對潛伏HIV-1的激活作用及其與DNA甲基化修飾的關係》是依託蘭州大學，由王曉霞擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：APOBEC3對潛伏HIV-1的激活作用及其與DNA甲基化修飾的關係
- 依託單位：蘭州大學
- 項目負責人：王曉霞
- 項目類別：青年科學基金項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
病毒潛伏庫的存在是全面清除HIV-1感染的主要障礙，而HIV-1 5' LTR的CpG甲基化是病毒潛伏庫維持的重要因素。如何有效的激活潛伏病毒，已成為目前清除潛伏庫、治癒愛滋病的關鍵。我們前期研究發現：APOBEC3(A3)家族成員A3A可激活潛伏病毒，並推測這與A3A利用其甲基化胞嘧啶脫氨酶活性，催化5' LTR甲基化CpG去甲基化有關。本項目在此基礎上，首先利用體外實驗，篩選出A3家族中具有甲基化胞嘧啶脫氨酶活性的分子；然後在5'LTR高度甲基化的J-Lat潛伏細胞中，利用重亞硫酸鹽測序、qRT-PCR，探討這些分子對5' LTR CpG甲基化程度、病毒活化的調節作用；並通過RNA干擾、Co-IP和ChIP，對其催化5' LTR DNA去甲基化的分子機制進行研究。以期揭示A3在激活HIV-1中的作用及其表觀遺傳學機制，為新型病毒激活劑的研發奠定基礎。
結題摘要
HIV-1 5'LTR作為病毒轉錄的唯一起點，該區域內胞嘧啶的甲基化修飾（5mC）與病毒潛伏感染的維持密切相關。APOBEC3（A3）是一類具有DNA編輯功能的胞嘧啶脫氨酶，為明確A3家族分子對HIV-1 5'LTR中5mC的識別及甲基化程度的調節作用，本項目首先建立了以HIV-1 5'LTR為啟動子的DNA甲基化/去甲基化報告系統pLTR-Luc2P-EGFP，通過檢測代表下游基因表達水平的螢光素酶活性，即可真實、有效地反映出被轉染細胞內5'LTR中5mC的甲基化程度。隨後，利用該系統對A3分子5mC去甲基化能力進行評價。結果顯示A3A去甲基化能力最強，A3B和A3C次之，A3G和A3F不具有該功能。通過與不具酶活性的A3A-E72A比較證實，胞嘧啶脫氨酶活性是其發揮去甲基化功能所必須的。最後，為探討A3催化DNA去甲基化的分子機制，以催化能力最強的A3A為研究對象，通過加入抑制劑、干擾RNA等方式對鹼基切除修復（BER）途徑中多個環節進行阻斷，證實A3A是通過胞嘧啶脫氨基-BER途徑催化5mC去甲基化的。同時，Co-IP研究發現A3A可與該通路中下游元件TDG、MBD4相互作用。至此，本項目證實了在A3家族中，部分A3分子可識別HIV-1啟動子5'LTR中5mC，並誘導其主動去甲基化，激活下游基因的表達。同時闡明了其誘導5mC去甲基化的分子機制，即A3分子通過催化5mC脫氨基，形成胸腺嘧啶，通過胞嘧啶脫氨基-BER途徑，完成DNA主動去甲基化。本項目從分子水平上對細胞內HIV-1啟動子5'LTR中5mC主動去甲基化過程進行了解讀，闡明了胞嘧啶脫氨酶A3在5mC去甲基化中的作用，極大地推動了對DNA主動去甲基化機制的認識。同時為潛伏感染細胞內，HIV-1的活化提供新的思路，為研發高效、安全、可行性高的潛伏感染激活劑，清除潛伏庫提供了新的靶點。
