《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》是富力於2006年5月22日申請的專利，該專利的申請號為2006100466172，公布號為CN1883492，授權公布日為2006年12月27日，發明人是富力、赫瀾銘、劉紅、魯明明、魯岐。
一種20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液，其含原料0.5～10毫克/毫升，其製備方法：將0.1～5％的人參皂苷溶液加到溫度為40～100℃的0.1～30％輔料A、B①②⑤水溶液中，兩者重量比為1:1～300，減壓回收溶劑後加水；另一種含原料0.1～2毫克/毫升的20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液，其製備方法：將0.1～5％的人參皂苷溶液加到溫度為60～100℃的20～65％輔料B③④的水溶液中，兩者重量比為1:100～400，減壓回收溶劑後加水；上述20（R）－人參皂苷Rg3組合物水溶液及乾燥後所得水溶性粉末，用其製備注射、口服和外用藥物製劑的生物利用度較高，其具有抗腫瘤、合併放化療增效減毒、提高免疫功能、抗疲勞、改善記憶、消腫止痛及癒合傷口的作用。
2016年12月7日，《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法
- 公布號：CN1883492
- 授權日：2006年12月27日
- 申請號：2006100466172
- 申請日：2006年5月22日
- 申請人：富力
- 地址：遼寧省大連市大連開發區鐵山中路5號大連富生藥物公司
- 發明人：富力、赫瀾銘、劉紅、魯明明、魯岐
- Int.Cl.：A61K31/704(2006.01)；A61K9/08(2006.01)；A61K9/19(2006.01)；A61P35/00(2006.01)
- 代理機構：大連萬友專利事務所
- 代理人：王麗英
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
人參皂苷Rg3是存在於人參中的一種四環三萜類皂苷化合物，分子量為784.13，它又以20（R）-人參皂苷Rg3和20（s）-人參皂苷Rg3兩種光學異構體形式存在，其中20（R）-人參皂苷Rg3化學性質穩定，不溶於水，而20（s）-人參皂苷Rg3化學性質不穩定，易溶於水，它們的結構式分別是：
人們發現，20（R）-人參皂苷Rg3具有較強的抑制腫瘤和抗轉移作用，但它又是一種不溶於水的物質，因此其口服製劑的生物利用度很低，極大地限制了其臨床藥效的發揮，同時也限制了非腸道給藥途徑。
為使20（R）-人參皂苷Rg3溶於水，人們對此進行了研究，如在2003年1月29日發明專利公報上公開的一種<人參皂甙Rg3羥丙基-β-環糊精包合物及製劑和製備方法>（申請號01119929.6）其主要內容是：人參皂甙Rg3的羥丙基-β-環糊精包合物，它是由下述原料按下述重量比組成的，即人參皂甙:羥丙基-β-環糊精＝1:1～20；要製備方法是（1）將人參皂甙Rg3溶於有機溶劑中，（2）將羥丙基-β-環糊精溶於水中，（3）在強烈攪拌下將人參皂甙Rg3溶液緩慢滴加到含羥丙基-β-環糊精的水溶液中，全部加完後繼續攪拌2～24小時，使用0.45微米微孔濾膜過濾，將濾液濃縮，除盡有機溶劑，加入注射水重新溶解，過0.22微米膜，濾液冷凍乾燥，得疏鬆白色粉末，即為人參皂甙包合物。
不足之處是：（1）包合物在製備過程中，將其反應液回收至原體積的1/3時，經測定仍有較多有機溶劑殘留，而冷凍乾燥對除去殘留溶劑無效，因而該包合物粉末用於製備注射劑難於符合注射劑殘留溶劑的限定標準。（2）包合物在製備過程中，由於殘留有機溶劑的存在，有助於人參皂甙Rg3與羥丙基-β-環糊精以1:1～200的比例形成溶於水的包合物，如果將殘留有機溶劑真正除盡，則在上述比例範圍內不能形成穩定的易溶於水的包合物，人參皂甙Rg3很快會從其包合物水溶液中析出沉澱，使得該包合物不能用於製備注射劑。（3）人參皂甙Rg3不能全部形成包合物，利用率僅為86％，使其作為注射劑的生產成本明顯增高。
發明內容
專利目的
《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》的目的在於提供一種產品成本低、易被人體吸收的20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物和製劑以及它們的製備方法與醫藥用途。
技術方案
《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》的主原料（簡稱原料）為20（R）-人參皂苷Rg3。《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》的輔原料（簡稱輔料）為A、B兩類，A類為脫氧膽酸（鈉）、十二烷基硫（磺）酸鈉及精氨酸；B類為環糊精，其包括：①環糊精及其衍生物，如聚合環糊精納米微粒、聚合環糊精、支鏈環糊精，②β-環糊精及其衍生物，如β-環糊精、2，6-二甲基-β-環糊精、葡萄糖基-β-環糊精、納米基-β-環糊精、磺丁醚β-環糊精、甲基-β-環糊精、不定位甲基化-β-環糊精，③羥丙基-β-環糊精及其衍生物，如2-羥丙基-β-環糊精、3-羥丙基-β-環糊精衍生物、2，3-二羥丙基-β-環糊精、2，3，6，-三羥丙基-β-環糊精，④羥乙基-β-環糊精；⑤環糊精及其衍生物混合輔料，由上述環糊精、β-環糊精、羥丙基和羥乙基-β-環糊精及其衍生物間的以不同組合混合形成的混合物。
《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》原料與輔料的重量比如下：20（R）-人參皂苷Rg3:輔料A或B①②⑤＝1:1～300，20（R）-人參皂苷Rg3:輔料B③④＝1:100～400。
20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物的製備方法：
（1）制原料液：將原料20（R）-人參皂苷Rg3溶於混合有機溶劑中，製成0.1～5％的人參皂苷溶液，所用的混合有機溶劑及它們的比例如下：1）氯仿:乙酸乙酯:乙醇（甲醇）:水＝10～25:30～45:18～30:5～15，下層；2）氯仿:乙醇（甲醇）:水＝70～60:40～30:10，下層；3）乙醇:水＝90～95:10～5；4）甲醇:水＝85～90:15～10；5）乙腈:水＝40～60:60～40；6）二氯甲烷:乙醇（甲醇）:水＝60～65:40～35:10；7）乙腈:乙醇（甲醇）＝70～80:30～20；8）二甲基亞碸:水＝90～80:10～20；9）丙二醇:乙醇（甲醇）:吐溫80:水＝40～50:10～20:1:49:29。
（2）制輔料液：1）分別將上述A、B兩類輔料溶於水中，製成0.1～30％的水溶液（a），2）分別將上述B類③④組的輔料溶於水中，製成20～65％的水溶液（b）。
（3）原料液加入到輔料液中：1）將上述人參皂苷溶液一次性加入到溫度為40～100℃的上述輔料水溶液（a）中並攪拌0.1～3小時，即可得到澄明液；或2）將上述人參皂苷溶液勻速滴加到溫度為60～100℃的上述輔料水溶液（b）中，並攪拌至滴加人參皂苷溶液完畢後停止，即可得到澄明液。
（4）回收溶劑並製得藥用組合物：將由上述步驟（3）獲得的澄明液在真空度0.01～0.08兆帕、溫度80～100℃條件下減壓回收溶劑至原體積的2/3～近乾，加水至原體積，溶解並減壓回收溶劑至近乾，再重複上述操作兩次，最終加入注射用水或純化水搖勻溶解，該水溶液即為20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物溶液，其中，20（R）-人參皂苷Rg3與A、B①②⑤兩類輔料分別製成的組合物溶液含原料0.5～10毫克/毫升；20（R）-人參皂苷Rg3與B類③④組輔料分別製成的組合物溶液含原料0.1～2毫克/毫升；經乾燥如真空、噴霧或冷凍乾燥可得到20（R）-人參皂苷Rg3水溶性藥用組合物粉末，其乾燥方法及乾燥條件如下：
乾燥方法 | 乾燥條件 |
真空乾燥 | 在30～60℃溫度，0.01～0.08兆帕壓力下，乾燥48小時。 |
噴霧乾燥 | 採用超音速射流技術，射流技術300～900米/秒，在30～60℃溫度，0.01～0.05兆帕壓力下，以超音速速度瞬時乾燥。 |
冷凍乾燥 | 先於-45℃預凍5小時；按程式升溫冷凍乾燥：-45～-15℃升華乾燥20小時，再於-15～30℃真空乾燥10小時。 |
用上面得到的20（R）-人參皂苷Rg3水溶性藥用組合物作原料，可製備下述各種製劑：
1.口服及外用藥製劑：用A、B輔料與原料反應獲得的20（R）-人參皂苷Rg3組合物溶液，經乾燥後形成可溶於水的人參皂苷Rg3固體粉末，再與藥學上可接受的載體配合，經製劑工藝可製成各種製劑：如顆粒劑、片劑（普通片、分散片、緩釋片、控釋片等）、軟（硬）膠囊、口服液、外用劑（貼劑、軟膏、滴劑、氣霧劑）。
2.注射劑：用輔料A或輔料B③④與原料反應獲得的20（R）-人參皂苷Rg3水溶性藥物組合物溶液：1）經超濾器或加入是其重量0.1％注射級活性炭混合均勻，於80℃保溫30分鐘後，用0.45微米濾膜過濾除熱源，經0.22微米微孔濾膜過濾除菌可製成注射液，或再經冷凍乾燥後可製成凍乾粉針劑或注射用無菌粉末。2）經減壓回收溶劑及乾燥（真空、噴霧或冷凍乾燥）製成穩定的易溶於水的人參皂苷Rg3固體粉末，復溶後再製成凍乾粉針劑或注射用無菌粉末。
上述20（R）-人參皂苷Rg3藥用固體和液體組合物及其藥物製劑具有抑制腫瘤生長和轉移、與放化療合併用藥增效減毒、提高機體免疫功能、抗疲勞、改善記憶、外用消腫止痛及癒合傷口的作用。
改善效果
1.《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》製備的20（R）-人參皂苷Rg3組合物溶液經乾燥後可得到完全溶解於水、不含殘留有機溶劑的粉末，由此可製成符合《中華人民共和國藥典》注射劑質量要求的凍乾粉針注射劑，也可製成多種口服及外用藥物製劑。
2.《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》製備的20（R）-人參皂苷Rg3組合物注射劑或口服製劑，均比2006年5月前口服製劑（商品名：參一膠囊）的生物利用度顯著提高：前者經注射可100％進入動物及人體的血液中，其絕對生物利用度為100％，比2006年5月前口服製劑提高20-50倍；後者也比2006年5月前口服製劑的生物利用度提高10倍以上。
3.《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》製備的20（R）-人參皂苷Rg3可與輔料100％的形成組合物溶液，經乾燥可製成凍乾粉針劑，使20（R）-人參皂苷Rg3原料利用率達100％，其成本明顯低於該成分的包合物凍乾粉針劑的成本。
4.《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》製備的20（R）-人參皂苷Rg3組合物口服藥物製劑，因其生物利用度提高可減半量服用即達到與2006年5月前膠囊劑相同或更好的療效，使腫瘤患者醫藥費大幅度降低。
5.《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》製備的20（R）-人參皂苷Rg3組合物注射劑在大鼠及犬的肝臟、胃腸壁分布濃度較高，使其對消化道腫瘤及轉移具有良好的治療作用。
附圖說明
圖1是20（R）-人參皂苷Rg3標準品高效液相色譜檢測譜圖。
圖2是20（R）-人參皂苷Rg3與脫氧膽酸鈉組合物高效液相色譜圖。
圖3是20（R）-人參皂苷Rg3標準品高效液相色譜圖。
圖4是20（R）-人參皂苷Rg3與十二烷基硫酸鈉組合物高效液相色譜圖。
圖5是20（R）-人參皂苷Rg3標準品高效液相色譜圖。
圖6是20（R）-人參皂苷Rg3與2，3，6-三羥丙基-β-環糊精組合物高效液相色譜圖。
圖7是20（R）-人參皂苷Rg3標準品高效液相色譜圖。
圖8是20（R）-人參皂苷Rg3與β-環糊精組合物高效液相色譜圖。
圖9是7隻犬口服給予5.6克Rg3顆粒劑後血漿藥物濃度時間曲線。
圖10是7隻犬口服給予3粒克Rg3參一膠囊後血漿藥物濃度時間曲線。
圖11是7隻犬分別口服給予Rg3顆粒劑和參一膠囊後_血漿藥物濃度時間曲線。
技術領域
《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》涉及一種人參皂苷藥用組合物及其製備方法。
權利要求
1.一種20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液，其特徵在於：該水溶液中20（R）-人參皂苷Rg3的含量為0.5～10毫克/毫升。
2.一種20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液的製備方法，其特徵在於：（1）將原料20（R）-人參皂苷Rg3溶於混合有機溶劑中，製成0.1～5％的人參皂苷溶液，（2）分別將A、B①②⑤兩類輔料溶於水中，製成0.1～30％的輔料水溶液，（3）將上述人參皂苷溶液一次性加入到40～100℃的上述輔料水溶液中，其中原料:輔料A＝1:1～300，原料:輔料B＝1:100～400，攪拌0.1～3小時即得澄明液，（4）將澄明液在真空度0.01～0.08兆帕、溫度80～100℃減壓回收溶劑至原體積的2/3～近乾，加水至原體積，溶解並減壓回收溶劑至近乾，再重複上述操作一次，最終加入注射用水或純化水搖勻溶解。
3.一種20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液，其特徵在於：該水溶液中20（R）-人參皂苷Rg3的含量為0.1～2毫克/毫升。
4.一種20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液的製備方法，其特徵在於：（1）將原料20（R）-人參皂苷Rg3溶於混合有機溶劑中，製成0.1～5％的人參皂苷溶液，（2）分別將B類③④組的輔料溶於水中，製成20～65％的輔料水溶液，（3）將上述人參皂苷溶液勻速滴加到溫度為60～100℃的上述輔料水溶液中，其中原料：輔料B＝1::100～400，並攪拌到滴加人參皂苷溶液完畢後停止，即得澄明液，（4）將澄明液在真空度0.01～0.08兆帕、溫度80～100℃減壓回收溶劑至原體積的2/3～近乾，加水至原體積，溶解並減壓回收溶劑至近乾，再重複上述操作一次，最終加入注射用水或純化水搖勻溶解。
5.一種20（R）-人參皂苷Rg3水溶性粉末的製備方法，其特徵在於：製得的20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液乾燥後，可製得20（R）-人參皂苷Rg3水溶性粉末。
6.一種20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物凍乾粉針劑的製備方法，其特徵在於：用原料與輔料A或輔料B③④製得的20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液經超濾器加入其重量0.1％針劑用活性炭，混合均勻，於80℃保溫30分鐘後，用0.45微米濾膜過濾除熱源，無菌條件下用0.22微米微孔濾膜過濾除菌分裝，冷凍乾燥。
7.一種20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物凍乾粉針劑的製備方法，其特徵在於：用原料與輔料A或輔料B③④製得的20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液經乾燥後製得的20（R）-人參皂苷Rg3水溶性粉末，再加入注射用水復溶，加入其重量0.1％針劑用活性炭，混合均勻，於80℃保溫30分鐘後，用0.45微米濾膜過濾除熱源，無菌條件下用0.22微米微孔濾膜過濾除菌分裝，冷凍乾燥。
8.一種20（R）-人參皂苷Rg3藥用組合物，其特徵在於：它的溶液、水溶性粉末及其藥物製劑作為製備抗腫瘤、合併放化療增效減毒、提高免疫功能、抗疲勞、改善記憶、消腫止痛及癒合傷口藥物的套用。
實施方式
- 實施例1
將1克20（R）-人參皂苷Rg3用氯仿-乙酸乙酯-乙醇-水（10:30:18:5，下層液）溶解配成0.1％溶液；另取100g脫氧膽酸鈉，用注射用水溶解並加熱至40℃，配成30％的溶液。將配好的人參皂苷溶液加入到上述脫氧膽酸鈉溶液中，攪拌3小時，得澄明的溶液組合物製備液；過濾，於真空度0.01兆帕、溫度100℃旋轉蒸發器上減壓回收溶劑至近乾，加蒸餾水至原體積，溶解並回收溶劑至近乾，再重複一次上述操作，至除盡有機溶劑。加注射用水至100毫升，即得20（R）-人參皂苷Rg3與脫氧膽酸鈉形成的組合物溶液100毫升。經高效液相法測定該組合物溶液中人參皂苷Rg3含量為10毫克/毫升，見圖1和2。
- 實施例2
將0.5克20（R）-人參皂苷Rg3用氯仿-乙酸乙酯-乙醇-水（25:45:30:15，下層液）溶解配成5％溶液；另取100g十二烷基硫酸納，用注射用水溶解並加熱至100℃，配成0.1％的溶液。將配好的人參皂苷溶液加入上述十二烷基硫酸納水溶液中，攪拌0.1小時，得澄明的溶液組合物製備液；過濾，於真空度0.08兆帕、溫度80℃旋轉蒸發器上減壓回收溶劑至原體積1/4；加蒸餾水至原體積，溶解並回收溶劑至近乾，再重複一次上述操作，至除盡有機溶劑，加純化水至1000毫升，即得20（R）-人參皂苷Rg3與十二烷基硫酸納形成的溶液組合物1000毫升。經高效液相法測定該組合物溶液中人參皂苷Rg3含量為0.5毫克/毫升，見圖3和4。
- 實施例3
將5克20（R）-人參皂苷Rg3用氯仿-乙醇-水（70:30:10，下層液）溶解配成0.1％溶液；另取500克2，3，6-三羥丙基-β-環糊精，加蒸餾水加熱至60℃溶解，配成20％溶液。在攪拌條件下，將配好的人參皂苷溶液以10毫升/分勻速滴加到上述2，3，6-三羥丙基-β-環糊精溶液中，滴加完該溶液即停止攪拌。於真空度0.05兆帕、溫度100℃旋轉蒸發器上減壓回收近乾，加蒸餾水至原體積，溶解並回收溶劑至近乾，再重複一次上述操作。用2.5升注射用水溶解濃縮物，得到的水溶液即為20（R）-人參皂苷Rg3水溶性中間體。經高效液相法測定，該水溶性中間體含人參皂苷Rg3為2毫克/毫升，見圖5和6。
- 實施例4
將2克20（R）-人參皂苷Rg3用氯仿:乙醇:水（70:30:10，下層液）溶解配成5％溶液；另取600克β-環糊精，加蒸餾水加熱至40℃溶解，配成30％溶液。在攪拌條件下，將配好的人參皂苷溶液以5毫升/分勻速滴加到β-環糊精溶液中，滴加完該溶液即停止攪拌。於真空度為0.04兆帕、旋轉蒸發器上減壓回收近乾，加蒸餾水至原體積，溶解並回收溶劑至近乾，再重複一次上述操作，用20升注射用水溶解濃縮物，得到的水溶液即為20（R）-人參皂苷Rg3水溶性中間體。經高效液相法測定，該水溶性中間體含人參皂苷Rg3為0.1毫克/毫升，見圖7和8。
- 實施例5～43
實施例 | 原料（克） | 溶解原料的混合有機溶劑（毫升） | 輔料（克） | 輔料溶液濃度％ | 增溶反應溫度（℃） | 攪拌時間（小時） | 原料:輔料 | Rg3毫克/毫升 |
5 | 0.2 | 氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（25:45:30:15，下層）80 | 脫氧膽酸鈉0.2 | 0.1 | 40 | 0.1 | 1:1 | 0.5 |
6 | 1 | 氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（25:45:30:15，下層）800 | 脫氧膽酸100 | 10 | 60 | 3 | 1:100 | 10 |
7 | 1 | 氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（25:45:30:15，下層）800 | 脫氧膽酸50 | 30 | 60 | 0.5 | 1:100 | 10 |
8 | 1 | 乙醇-水（90:10）1000 | 十二烷基硫酸鈉5 | 5 | 50 | 2 | 1:5 | 5 |
9 | 10 | 乙腈-甲醇（70:30）1000 | 十二烷基磺酸鈉400 | 20 | 55 | 3 | 1:40 | 2 |
10 | 5 | 乙腈-甲醇（80:20）500 | 十二烷基磺酸鈉100 | 10 | 45 | 1.5 | 1:20 | 1 |
11 | 1 | 二甲基亞碸:水（90:10）50 | 精氨酸100 | 20 | 50 | 1 | 1:100 | 2 |
12 | 5 | 二甲基亞碸:水（80:20）250 | 精氨酸100 | 25 | 50 | 1 | 1:20 | 1 |
13 | 5 | 氯仿-甲醇-水（70:30:10，下層）5000 | 聚合環糊精納米粒500 | 30 | 100 | 5 | 1:100 | 1 |
14 | 2 | 氯仿-甲醇-水（60:40:10，下層）200 | 聚合環糊精納米粒200 | 10 | 80 | 2 | 1:100 | 2 |
15 | 1 | 乙醇-水（95:5）500 | 聚合環糊精100 | 20 | 65 | 2.3 | 1:100 | 0.5 |
16 | 1 | 乙醇-水（90:10）600 | 聚合環糊精150 | 30 | 85 | 2.6 | 1:150 | 0.8 |
17 | 0.5 | 甲醇-水（90:10）250 | 支鏈環糊精200 | 10 | 100 | 1 | 1:200 | 0.5 |
18 | 0.5 | 甲醇-水（85:15）200 | 支鏈環糊精300 | 15 | 95 | 0.8 | 1:300 | 0.9 |
19 | 1 | 乙腈-水（40:60）500 | β-環糊精150 | 30 | 65 | 1.3 | 1:150 | 1 |
20 | 300 | 二甲基亞碸:水（90:10）1000 | 2，6-二甲基-β-環糊精3000 | 30 | 100 | 3 | 1:10 | 1 |
21 | 5 | 二甲基亞碸:水（80:20）125 | 2，6-二甲基-β-環糊精800 | 25 | 95 | 3 | 1:160 | 2 |
22 | 1 | 乙腈-甲醇（70:30）200 | 納米基-β-環糊精90 | 0.5 | 60 | 0.7 | 1:90 | 0.5 |
23 | 3 | 乙腈-甲醇（80:20）3000 | 納米基β-環糊精150 | 30 | 60 | 3 | 1:50 | 2 |
24 | 2 | 乙腈-乙醇（70:30）200 | 磺丁醚β-環糊精140 | 25 | 75 | 1 | 1:70 | 0.5 |
25 | 2 | 乙腈-乙醇（80:20）400 | 磺丁醚β-環糊精180 | 15 | 95 | 3 | 1:90 | 1 |
26 | 1 | 丙二醇:乙醇:吐溫80:水（40:10:1:49）600 | 甲基-β-環糊精300 | 30 | 60 | 2 | 1:300 | 0.5 |
27 | 1 | 丙二醇:乙醇:吐溫80:水（50:20:1:29）40 | 甲基-β-環糊精150 | 25 | 65 | 1.2 | 1:150 | 1 |
28 | 1 | 丙二醇:甲醇:吐溫80:水（40:10:1:49）50 | 不定位甲基化-β-環糊精240 | 20 | 100 | 2.5 | 1:240 | 0.5 |
29 | 1 | 丙二醇:甲醇:吐溫80:水（50:20:1:29）65 | 不定位甲基化-β-環糊精300 | 30 | 95 | 1.2 | 1:300 | 0.8 |
302 | 2 | 二氯甲烷-甲醇-水（65:35:10，下層）200 | 2-羥丙基-β-環糊精200 | 40 | 60 | 1.3 | 1:100 | 2 |
31 | 2 | 二氯甲烷-甲醇-水（60:40:10，下層）350 | 2-羥丙基-β-環糊精600 | 60 | 65 | 4.8 | 1:300 | 0.1 |
32 | 1 | 二氯甲烷-乙醇-水（65:35:10，下層）300 | 3-羥丙基-β-環糊精120 | 65 | 70 | 0.9 | 1:120 | 2 |
33 | 1 | 二氯甲烷-乙醇-水（60:40:10，下層）500 | 3-羥丙基-β-環糊精300 | 65 | 80 | 1.3 | 1:300 | 0.8 |
34 | 2 | 氯仿-乙醇-水（70:30:10，下層）350 | 2，3-二羥丙基-β-環糊精200 | 50 | 60 | 1.5 | 1:100 | 1.5 |
35 | 2 | 氯仿-乙醇-水（60:40:10，下層）250 | 2，3-二羥丙基-β-環糊精400 | 50 | 70 | 2 | 1:200 | 0.6 |
36 | 5 | 二甲基亞碸:甲醇（80:20）25 | 2，3，6-三羥丙基-β-環糊精500 | 65 | 65 | 1.7 | 1:100 | 0.1 |
37 | 0.5 | 二甲基亞碸:乙醇（90:10）30 | 羥乙基-β-環糊精75 | 30 | 80 | 0.45 | 1:150 | 0.5 |
38 | 0.5 | 二甲基亞碸:乙醇（80:20）400 | 羥乙基-β-環糊精175 | 60 | 85 | 0.5 | 1:350 | 0.2 |
39 | 1 | 氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（25:45:30:15，下層）500 | β-環糊精與2-羥丙基-β-環糊精混合物（1:1）150 | 25 | 60 | 1.7 | 1:150 | 2 |
40 | 1 | 氯仿-甲醇-水（70:30:10，下層）330 | 2-羥丙基-β-環糊精與3-羥丙基-β-環糊精混合物（1:5）400 | 20 | 70 | 2.6 | 1:400 | 1 |
41 | 1 | 乙腈-乙醇（70:30）100 | 聚合環糊精納米粒、β-環糊精混合物、磺丁醚β-環糊精混合物（1:1:1）90 | 50 | 95 | 1.4 | 1:90 | 0.5 |
42 | 2 | 二甲基亞碸:甲醇（80:20）100 | 2-羥丙基-β-環糊精、3-羥丙基-β-環糊精與2，3，6-三羥丙-基-β-環糊精混合物（1:5:10）480 | 60 | 80 | 1.5 | 1:240 | 2 |
43 | 0.5 | 丙二醇:乙醇:吐溫80:水（40:10:1:49）200 | β-環糊精、聚合環糊精與2-羥丙基-β-環糊精混合物（2:5:5）200 | 45 | 85 | 1.1 | 1:400 | 2 |
- 實施例44
取實施例1製得的20（R）-人參皂苷Rg3組合物溶液100毫升，加入注射用水至1000毫升，再加0.1克針劑用活性炭混合均勻，於80℃保溫30分鐘後用0.45微米濾膜濾過除熱原，無菌條件下用0.22微米微孔濾膜濾過除菌，於無菌條件下灌裝至10毫升管制無菌西林瓶中，裝量每瓶約4.5～4.9毫升:5毫克，並將裝好後的西林瓶加半塞，置凍乾機（LYO-5，上海產）盤上，關好門，開動凍乾機，先冷凍至-40℃以下，保持4小時後，開動真空乾燥，並按45℃～-30℃/4小時、-30℃～-20℃/4小時、-20℃～-15℃/2小時升華，再於15℃～30℃升溫乾燥4小時，即完成冷凍乾燥後，壓塞，軋鋁蓋，取樣檢測，合格後包裝，即得1000支注射用凍乾粉針劑（每支含Rg31毫克）。由實施例2-40均可按上述操作步驟進行，製得水溶性粉末。
- 實施例45
取實施例20製得的20（R）-人參皂苷Rg3組合物溶液50升，置於雙錐迴轉真空乾燥箱（型號SZG-4500，常州產）的不鏽鋼乾燥盤上，於80℃、1.3帕真空度條件下進行真空乾燥12小時，得水溶性粉末；或者將上述組合物溶液置於組合式噴霧乾燥機（ZPG-105，常州產）的流化床乾燥器中，在20℃下，用雙咀組份噴咀以0.8千克/小時速率將含有20％固形物的組合物溶液連續噴入到流化床中，流化氣體輸入溫度150℃，噴入的量使液化床的溫度達到75℃，可得100～250微米的得水溶性粉末55千克；或者將上述乾燥後的水溶性粉末復溶，再按實施例35冷凍乾燥方法操作，即得凍乾粉針劑10000支（每支5毫克）。
- 實施例46 20（R）-人參皂苷Rg3組合物顆粒劑體內提高生物利用度的試驗
我們比較測定了Beagle犬口服20（R）人參皂苷Rg3組合物顆粒劑與原料膠囊劑後的血藥濃度（委託瀋陽藥科大學藥物代謝與藥物動力學實驗室完成該項試驗），證明Beagle犬口服20（R）人參皂苷Rg3組合物製成的顆粒劑的血藥濃度高於其20（R）人參皂苷Rg3原料製成的膠囊劑12～20倍，從而說明Rg3組合物顆粒劑在動物體內的生物利用度明顯高於Rg3原料製成的膠囊劑。
給予Beagle犬口服實施例37製得的20（R）-人參皂甙Rg3組合物顆粒劑，測定了其生物利用度。生物樣品的測定利用API4000型質譜儀，採用液相色譜-串聯質譜聯用分析方法。7隻犬口服給予5.6g人參皂甙Rg3與β-環糊精（1:200）藥用組合物（含Rg330毫克）後血漿藥物濃度時間曲線見附圖9，7隻犬口服給予3粒參一膠囊（含Rg330毫克，Rg310毫克/粒）後血漿藥物濃度時間曲線見附圖10，兩個試驗組平均血漿藥物濃度時間曲線見附圖11。口服給予所述藥用組合物後，血漿藥物濃度於2.3±0.9小時達到峰濃度為6.8±1.8納克/毫升，半衰期為6.0±0.9小時，藥時曲線下面積（AUC0-t）為40.0±15.7納克·小時/毫升。
- 實施例47 20（R）-人參皂苷Rg3組合物凍乾粉針劑抗腫瘤藥效學試驗
1.試驗藥物及配製方法
受試藥物：人參皂苷Rg3凍乾粉針劑；批號：20030519，規格：5毫克/支。
配製方法：精密量取一定量的人參皂苷Rg3凍乾粉針劑或相應輔料加入生理鹽水至所需濃度即可，給藥體積0.5毫升/鼠。
2.實驗材料
2.1溶劑生理鹽水。
2.2陽性對照品注射用環磷醯胺（CTX），上海華聯製藥集團生產；每天一次，連續七天；5Fu注射液，上海旭東海普藥業有限公司生產；注射用絲裂黴素（MMC），日本協和發酵工業株式會社生產。
2.3瘤源人體的胃癌MGC模型、腸癌模型LOVO及肝癌QGY均第二代以上的腫瘤用作瘤源；小鼠B16黑色素瘤細胞模型等均由上海醫藥工業研究院藥理室傳代維持。
3.實驗動物
3.1來源裸小鼠由上海市中科院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK2003-0003。C57BL/6及昆明種小鼠由本院實驗動物組提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2004-0015。
3.2體重裸小鼠為6周齡，昆明種小鼠及C57BL/6小鼠為18～22克。
3.3性別雌雄皆可，每批實驗使用同一種性別。
3.4動物數試驗組及陽性對照組裸小鼠每組6隻小鼠，其他小鼠每組8-10隻，陰性對照各為兩組。
4.試驗設計
4.1劑量設定人參皂苷Rg3凍乾粉針劑給藥劑量設為：1.5毫克/千克/天、0.75毫克/千克/天，0.375毫克/千克/天。
4.2給藥方案靜脈給藥，每天2次，人體腫瘤模型及細胞接種的小鼠模型iv×14bid，小鼠腫瘤接種的模型iv×10bid的方案治療。
4.3試驗對照陰性對照：給以與試驗組相應輔料，給藥方案同試驗組；陽性對照：環磷醯胺CTX30毫克/千克、MMC2毫克/千克及5Fu30毫克/千克腹腔或靜脈給藥每天一次，連續七天。
5.試驗方法
5.1抗腫瘤試驗
5.1.1胃原位接種模型
無菌條件下取生長旺盛的體內傳2代的MGC胃癌，以勻漿法製備成約2×10/毫升細胞懸液，經手術於裸小鼠的胃大彎肌層內注射細胞懸液0.05毫升，次日按實驗設計方案給藥，按下列公式計算荷瘤宿主生命延長率：
生命延長率％＝給藥組平均生存天/對照組平均生存天×100％
5.1.2肝原位接種模型
無菌條件下取生長旺盛的體內傳第二代QGY瘤源，以勻漿法1:6製備成約1-2×10/毫升細胞懸液，勻漿經100目不鏽鋼篩網過濾，備用。裸小鼠常規消毒，麻醉於腹腔正中劍突下切開皮膚和腹腔，暴露肝臟，經肝實質部以進口的28ga1/2毫升注射器注射0.05毫升細胞懸液，關閉腹腔，逐層縫合腹腔及皮膚。裸小鼠置於層流架中飼養，所用的飼料、墊料、籠具及接觸的器械等均應高壓消毒後使用。次日按實驗設計方案給藥，觀察各組動物45天內的生存時間，與陰性對照組進行比較，統計生命延長率。
5.2增效試驗
5.2.1腋皮下接種模型
無菌條件下取生長旺盛的瘤源，以勻漿法製備成約1～2×10/毫升細胞懸液；於相應宿主腋皮下接種0.2毫升/每鼠，次日按實驗設計方案給藥，三周左右處死各組動物，剖取腫瘤稱重，按下列公式計算腫瘤抑制率：
腫瘤抑制率％＝[（對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/對照組平均瘤重]×100％
5.2.2尾靜脈接種模型
無菌條件下取對數生長期的B16小鼠黑色素瘤培養細胞，製備成約2.5×10/毫升細胞懸液，於C57BL/6小鼠尾靜脈接種0.2毫升/鼠，次日按實驗設計方案給藥，三周后處死各組動物，剖取各組小鼠的肺臟，計測每鼠肺臟所轉移的集落數，以各組腫瘤平均集落數，按下列公式計算腫瘤抑制率：
腫瘤抑制率％＝[（對照組平均集落數-給藥組平均集落數）/對照組平均集落數]×100％
5.3減毒試驗
觀察對人參皂苷Rg3凍乾粉針劑化療藥所致小鼠白細胞變化的影響。取C57BL/6小鼠80隻，從每鼠眼靜脈叢取血，按常規白細胞玻片計數法，計測各鼠白細胞數，選擇7500±300個白細胞/立方毫米的小鼠，隨機分組，每組10個小鼠。第0、2天除空白對照組以外，其餘各組均給以化療藥CTX100毫克/千克ip×2。按上述方案給藥，第0天開始測各組白細胞數，而後實驗期間每隔三天，檢測各組小鼠白細胞數，計算各時相各組小鼠的白細胞數均值及標準差，直至陽性對照組白細胞恢復正常數為止。
5.4免疫試驗
5.4.1對荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠的NK細胞活性試驗
取C57BL/6小鼠，趾皮下接種無菌製備的Lewis肺癌混懸液0.05毫升/鼠（約1×10個腫瘤細胞）。次日隨機分組，按實驗設計給藥，末次給藥後次日在無菌條件下取小鼠脾臟，用100目篩網製成單個脾細胞懸液，低滲除去紅細胞，將細胞懸液轉入培養瓶中，37℃5％CO2條件培養1小時後去除貼壁細胞，計數活細胞並調整細胞濃度為3×10個細胞/毫升作為效應細胞。靶細胞取L929體外培養細胞，常規培養24小時，以培養液調整細胞濃度為1.5×10個細胞/毫升，使效靶細胞之比為20:1。取96孔培養板分別加入效應細胞和靶細胞，另設效應細胞和靶細胞對照，於37℃5％CO2條件培養4小時後，加入MTT染色液，再培養2小時後加入消化液於次日測各孔OD值，按公式計算NK細胞毒活性。
NK細胞毒活性％＝{[靶細胞對照組OD均值-（實驗組OD均值-效應細胞OD均值）]/靶細胞對照組OD均值}×100％
5.4.2對正常昆明種小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能試驗
取雄性昆明種小鼠隨機分組，按實驗設計方案給藥，末次給藥後各組小鼠腹腔注射0.5％水解蛋白1.5毫升/只，24小時後腹腔注射每毫升1×10的雞紅細胞懸液0.2毫升/只；隔40分鐘後用生理鹽水洗脫、收集小鼠腹腔液；離心，取細胞沉澱液製成塗片，用甲醇固定，吉姆薩染色封片，用油鏡計數100個巨噬細胞中吞噬雞紅血球的巨噬細胞數及吞噬雞紅血球的總數，按下列公式計算吞噬百分比和吞噬指數。
5.4.3對Lewis肺癌C57BL/6小鼠的IL-2活性試驗
採用雙抗體夾心ELISA法，抗小鼠IL-2單抗包被於酶標板上，標本與標準品中的IL-2會與單抗結合，游離的成分被洗去，同時加入生物素化的抗小鼠IL-2抗體和辣根過氧化物酶標記的親合素，生物素與親合素特異性結合；抗小鼠IL-2抗體與結合在單抗上的IL-2結合而形成免疫複合物，洗去游離的成分。加入顯色劑，顯示藍色，加終止液變黃。在450納米處測OD值，IL-2濃度與OD450值之間呈正比，可通過所繪製的標準曲線求得樣本中的IL-2濃度。
吞噬百分比％＝（100個巨噬細胞中吞噬雞紅血球的巨噬細胞數/100個巨噬細胞）×100％
吞噬指數＝100個巨噬細胞中吞噬雞紅血球的總數/100個巨噬細胞
6.試驗結果
6.1Rg3凍乾粉針劑與膠囊劑治療肝癌療效的比較試驗結果表1-2；
6.2Rg3凍乾粉針劑治療腸癌、胃癌的療效試驗結果見表3-4；
6.3Rg3凍乾粉針劑增加化療藥物療效試驗結果見表5；
6.4Rg3凍乾粉針劑減輕化療藥物療效毒副作用療效試驗結見表6；
6.5Rg3凍乾粉針劑提高機體免疫功能療效試驗結果見表7-9。
表1人參皂苷Rg3凍乾粉針劑與膠囊劑對人體肝癌QGY療效的比較試驗結果（n＝3）
樣品 | 劑量毫克/千克/次 | 給藥方案 | 給藥總劑量（毫克） | 動物數（只）始/終 | 動物體重（g）開始 | 平均生存（d）X±SD | 生命延長率T/C×％ |
Rg3粉針劑 | 1.5 | iv×14bid | 42 | 6/0 | 22.3 | 29.60±2.4*** | 135.16 |
Rg3粉針劑 | 0.75 | iv×14bid | 21 | 6/0 | 21.7 | 28.50±3.3*** | 130.14 |
Rg3膠囊劑 | 3 | ig×14qd | 84 | 6/0 | 22 | 28.80±2.8*** | 131.51 |
CTX | 30 | ip×7qd | 210 | 6/0 | 21.7 | 34.50±4.0*** | 157.53 |
陰性對照組 | 相應輔料 | iv×14bid | 84 | 12/0 | 21.8 | 21.90±2.35 |
與陰性對照組相比，p值＜0.01，以生命延長率＞125％以上以抗腫瘤有效計。#膠囊劑商品名：參-膠囊。
表2 人參皂苷Rg3凍乾粉針劑與膠囊劑對小鼠黑色素B16
實驗肺轉移療效的比較試驗結果（n＝3）
樣品 | 劑量毫克/千克/天 | 給藥方案 | 給藥總劑量（毫克） | 動物數（只）始/終 | 動物體重（g）始/終 | 肺克隆數（只）X±SD | 抗轉移率％ |
Rg3粉針劑 | 1.5 | iv×14bid | 42 | 10/10 | 20.1/24.7 | 20.6±6.8*** | 55.33 |
Rg3粉針劑 | 0.3 | iv×14bid | 8.4 | 10/10 | 19.8/25.3 | 26.5±6.1*** | 42.54 |
Rg3膠囊劑 | 6 | ig×10qd | 60 | 10/10 | 19.8/24.8 | 22.8±6.7*** | 50.56 |
Rg3膠囊劑 | 3 | ig×10qd | 30 | 10/10 | 19.9/25.2 | 27.5±7.7*** | 40.37 |
CTX | 100 | ip×2qod | 200 | 10/10 | 19.8/22.6 | 3.5±3.7*** | 92.41 |
陰性對照組 | 相應輔料 | iv×14bid | 42 | 20/20 | 19.7/25.3 | 46.12±12.46 |
與陰性對照組相比p值＜0.01，下表同。
表3 人參皂苷Rg3凍乾粉針劑對人體腸癌LOVO療效試驗（n＝3）
樣品 | 劑量毫克/千克/天 | 給藥方案 | 給藥總劑量（毫克） | 動物數（只）始/終 | 動物體重（g）開始 | 平均生存（d）X±SD | 生命延長率T/C×％ |
Rg3粉針劑 | 3 | v×14bid | 42 | 6/0 | 21.5 | 21.88±5.8*** | 160.88 |
Rg3粉針劑 | 1.5 | iv×14bid | 8.4 | 6/0 | 22.7 | 21.72±3.1*** | 159.71 |
Rg3粉針劑 | 0.75 | iv×14bid | 60 | 6/0 | 22.4 | 20.30±4.7*** | 149.26 |
Rg3粉針劑 | 0.375 | iv×14bid | 30 | 6/0 | 21.9 | 17.95±3.5*** | 131.98 |
CTX | 30 | ip×7qd | 200 | 6/1 | 22.2 | 29.20±4.8*** | 214.71 |
陰性對照組 | 相應輔料 | iv×14bid | 42 | 12/12 | 21.1 | 13.60±2.39 |
表4 人參皂苷Rg3凍乾粉針劑對人體胃癌MGC（原位接種）療效試驗（n＝3）
樣品 | 劑量毫克/千克/天 | 給藥方案 | 給藥總劑量（毫克） | 動物數（只）始/終 | 動物體重（g）開始 | 平均生存（d）X±SD | 生命延長率T/C×％ |
Rg3粉針劑 | 3 | iv×14bid | 42 | 6/0 | 21.2 | 36.88±3.0*** | 162.04 |
Rg3粉針劑 | 1.5 | iv×14bid | 8.4 | 6/0 | 21.1 | 35.71±3.1*** | 156.9 |
Rg3粉針劑 | 0.75 | iv×14bid | 60 | 6/0 | 20.5 | 33.15±3.6*** | 145.65 |
Rg3粉針劑 | 0.375 | iv×14bid | 30 | 6/0 | 20.4 | 29.32±4.7*** | 128.82 |
CTX | 30 | ip×7qd | 200 | 6/2 | 21.8 | 41.20±3.8*** | 181.02 |
陰性對照組 | 相應輔料 | iv×14bid | 42 | 12/0 | 20.7 | 22.76±2.14 |
表5 人參皂苷Rg3凍乾粉針劑合併CTX對小鼠黑色素B16轉移的療效試驗（n＝3）
樣品 | 劑量毫克/千克/天 | 給藥方案 | 動物數（只）始/終 | 動物體重（g）始/終 | 平均生存（d）X±SD | 抗轉移率％ |
Rg3粉針劑 | 3 | iv×14bid | 10/10 | 20.3/25.3 | 19.1±7.9*** | 62.03 |
Rg3粉針劑 | 1.5 | iv×14bid | 10/10 | 20.5/25.2 | 22.4±6.9*** | 55.47 |
Rg3粉針劑 | 0.75 | iv×14bid | 10/10 | 19.5/24.7 | 27.3±8.7*** | 45.73 |
Rg3粉針劑 | 0.375 | iv×14bid | 10/10 | 20.4/25.2 | 30.2±7.3*** | 39.96 |
Rg3+CTX | 3.0+15 | iv×14bid+ip×7qd | 10/10 | 19.8/23.8 | 14.1±3.6*** | 71.97 |
Rg3+CTX | 1.5+15 | iv×14bid+ip×7qd | 10/10 | 19.1/24.5 | 16.3±6.1*** | 67.59 |
Rg3+CTX | 0.75+15 | iv×14bid+ip×7qd | 10/10 | 19.9/24.1 | 19.2±4.7*** | 61.83 |
Rg3+CTX | 0.375+15 | iv×14bid+ip×7qd | 10/10 | 19.6/24.2 | 21.9±7.6*** | 56.46 |
CTX | 15 | ip×7qd | 10/10 | 20.2/24.7 | 26.1±5.2*** | 48.11 |
CTX | 30 | ip×7qd | 10/10 | 19.9/22.6 | 3.30±2.6** | 93.44 |
陰性對照組 | 相應輔料 | iv×14bid | 20/20 | 20.1/25.5 | *50.3±13.1 |
表6 人參皂甙Rg3凍乾粉針劑對化療藥物的增效減毒作用的試驗結果（n＝20）
組別 | 劑量（毫克/千克） | 平均瘤重（g，X±SD）） | 抑瘤率（％） | WBC（10/L） | Hb（g/L） | RBC（10/L） | |
H2O（對照） | 1.5×8 | 1.84±0.85 | 6.3±0.8 | 93±2.5 | 3.2±0.1 | ||
Rg3 | 1.5×8 | 0.69±0.14** | 62.5 | 8.1±0.2** | 109±6.0** | 3.7±0.4** | |
化療藥 | CTX | 10×3 | 0.89±0.29** | 56.52 | 3.2±0.5** | 82±8.4** | 2.8±0.3** |
5FU | 25×3 | 1.08±0.34** | 41.3 | 3.9±0.3** | 90±13.0 | 3.1±0.4 | |
MTX | 5×3 | 0.27±0.01** | 85.32 | 1.6±0.1** | 51±1.0** | 1.8±0.1** | |
PDD | 1×3 | 1.09±0.30** | 40.76 | 6.0±0.2 | 90±6.0 | 3.1+0.2 | |
Rg3粉針劑+CTX | （1.5×8+10×3） | 0.48±0.12** | 73.91 | 7.1±0.3** | 85±3.6 | 2.8±0.8 | |
Rg3粉針劑+5FU | （1.5×3+25×3） | 0.95±0.17** | 48.37 | 7.8±0.3** | 87±14.0 | 2.8±0.8 | |
Rg3粉針劑+MTX | （1.5×8+5×3） | 0.20±0.04** | 89.13 | 5.2±0.8* | 91±10.0 | 3.1±1.0 | |
Rg3粉針劑+PDD | （1.5×8+1×3） | 1.03±0.28** | 44.02 | 6.6±0.8* | 103±18.0* | 3.6±0.5* | |
動物移植性腫瘤為小鼠肝癌（Heps）。與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，其他均P＞0.05。
表7 人參皂甙Rg3凍乾粉針劑對荷瘤小鼠NK活性影響的試驗結果
組別 | 劑量（毫克/千克） | 給藥方案 | OD值（X） | NK活性（％） |
Rg3粉針劑 | 3 | po×10qod | 0.387 | 42.29** |
0.6 | po×10qod | 0.351 | 46.41** | |
0.12 | po×10qod | 0.368 | 43.82** | |
對照組 | 100 | po×10qod | 0.381 | 41.83** |
人參總皂甙 | 相應混懸劑 | po×10qd | 0.525 | 19.84 |
0.655 |
**P＜0.01，靶細胞對照OD均值。
表8 人參皂甙Rg3凍乾粉針劑對荷瘤小鼠IL-2活性影響的試驗結果
組別 | 劑量（毫克/千克） | 給藥方案 | 動物數（只） | IL-2活性/cpm（X±SD） |
Rg3粉針劑 | 3 | po×10qod | 6 | 2836±326** |
0.6 | po×10qod | 6 | 3122±735** | |
0.12 | po×10qod | 6 | 2414±539** | |
人參總皂甙 | 100 | po×10qod | 6 | 2785±255** |
對照組 | 相應混懸劑 | po×10qod | 10 | 1351±127 |
**P＜0.01
表9 人參皂甙Rg3對正常小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能影響的試驗結果
組別 | 劑量（毫克/千克） | 給藥方案 | 吞噬活性（X+SD） | |
吞噬百分比 | 吞噬指數 | |||
Rg3粉針劑 | 3 | po×10qod | 31.80土10.00** | 0.55±0.11** |
0.6 | po×10qod | 32.80士10.30** | 0.58±0.14** | |
0.12 | po×10qod | 28.70士7.40** | 0.50士0.11** | |
人參總皂甙 | 100 | po×10qod | 29.60±10.00** | 0.55土0.11** |
對照組 | 相應混懸劑 | po×10qod | 20.90土5.80 | 0.34±0.10 |
**P＜0.01
- 實施例48 20（R）-人參皂苷Rg3組合物膠囊劑抗疲勞試驗
1.20（R）-人參皂苷Rg3組合物膠囊劑對小鼠的抗疲勞作用試驗
1.1材料和方法
1.1.1樣品：20（R）人參皂苷Rg3組合物膠囊劑內容物呈白色粉末，大連富生天然藥物開發有限公司提供，用蒸餾水配置所需濃度。
1.1.2試驗動物：一級昆明雄性小鼠240隻，由四川大學實驗動物中心提供。（動物合格證號：川實動管質第67號）
1.1.3劑量選擇：按人體推薦劑量（10毫克/60千克/天）的10倍、20倍、30倍（相當於動物的1.67、3.34、5.01毫克/千克/天）設低、中、高三個劑量組。
1.1.4實驗方法：按體重大小隨機分為一個陰性對照組和三個試驗組，以灌胃方式給樣（2％），每天一次，陰性對照組給予蒸餾水，連續30天。30天后分別測定各項指標。
1.1.4.1負重遊泳實驗：於末次灌胃後30分鐘，將小鼠負荷5％體重的鉛皮，放入游泳箱（水深30厘米，水溫25±0.5℃）中游泳，記錄小鼠自游泳起到死亡的時間即小鼠游泳時間。
1.4.1.2爬桿實驗：於末次灌胃後30分鐘，將小鼠放於爬桿架的有機玻璃棒上，使其肌肉處於靜力緊張狀態，記錄小鼠因肌肉疲勞從棒上跌下的時間，重複三次，累計連續三次的時間為爬桿時間（秒）。
1.4.1.3尿素氮、肝糖原測定：分別於末次灌胃後30分鐘，將小鼠放入游泳箱（水深30厘米，水溫30±0.5℃）中游泳90分鐘，取眼球血測定血清尿氮素含量（二乙醯-肟法），取肝臟測定肝糖原含量（蒽酮法）。
1.4.1.4乳酸測定：末次灌胃後30分鐘，眼球取血測定乳酸含量（SBA-生物感測儀器），將小鼠放入游泳箱（水深30厘米，水溫30±0.5℃）中游泳10分鐘，鼠尾根部負荷4％體重的鉛皮，分別於游泳後即刻、游泳後30分鐘眼球取血再測定乳酸含量。
1.4.1.5統計分析：實驗數據用SPSS9.0統計軟體進行方差分析、q檢驗或秩和檢驗。
1.2結果
2.120（R）-人參皂苷Rg3組合物膠囊劑對小鼠體重的影響
從表1可見，試驗中期和試驗結束時各劑量組小鼠體重與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。
組數 | 動物數（只） | 初始體重（g） | 中期體重（g） | 結束體重（g） |
陰性對照 | 57 | 20.58±1.51 | 30.04±3.44 | 34.04±4.21 |
低劑量組 | 59 | 20.61±1.43 | 28.34±2.95 | 33.08±3.88 |
中劑量組 | 58 | 20.71±1.41 | 29.90±3.12 | 32.83±3.65 |
高劑量組 | 58 | 20.62±1.48 | 28.36±2.77 | 32.34±3.29 |
2.220（R）-人參皂苷Rg3組合物膠囊劑對小鼠負重遊泳時間的影響
見表2，低、高劑量組小鼠負重遊泳時間較陰性對照組顯著延長（P＜0.05）。中劑量組與陰性對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。
組別 | 動物數（只） | 游泳時間（秒） | P值* |
陰性對照 | 14 | 387±239 | |
低 | 14 | 703±597 | ＜0.05 |
中 | 14 | 519±167 | ＞0.05 |
高 | 14 | 707±430 | ＜0.05 |
與陰性對照組比較
2.320（R）-人參皂苷Rg3組合物膠囊劑對小鼠爬桿時間的影響
見表3，低、中劑量組爬桿時間明顯長於陰性對照組（P＜0.05），高劑量組與陰性對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。
組別 | 動物數（只） | 爬桿時間（秒） | P值* |
陰性對照 | 13 | 172±115 | |
低 | 13 | 340±153 | ＜0.05 |
中 | 13 | 332±337 | ＜0.05 |
高 | 13 | 183±84 | ＞0.05 |
與陰性對照組比較
2.420（R）-人參皂苷Rg3組合物膠囊劑對小鼠運動後血清尿氮素的影響
見表4，中、高劑量組小鼠運動後血清尿氮素含量明顯低於陰性對照組（P＜0.05），低劑量組與陰性對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。
組別 | 動物數（只） | 血清尿素氮含量（毫克/分升） | P值* |
陰性對照 | 12 | 27.95±3.32 | |
低 | 12 | 26.66±4.24 | ＞0.05 |
中 | 12 | 24.89±3.70 | ＜0.05 |
高 | 12 | 22.92±2.25 | ＜0.05 |
與陰性對照組比較
2.520（R）-人參皂苷Rg3組合物膠囊劑對小鼠運動後肝糖原含量的影響
見表5，高劑量組小鼠運動後肝糖原含量明顯高於陰性對照組（P＜0.05），其他劑量組與陰性對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。
組別 | 動物數（只） | 肝糖原含量（毫克/分升） | P值* |
陰性對照 | 15 | 1817.07±1076.76 | |
低 | 14 | 2327.14±1075.33 | ＞0.05 |
中 | 15 | 1942.53±761.87 | ＞0.05 |
高 | 14 | 2611.78±1049.64 | ＜0.05 |
與陰性對照組比較
2.620（R）-人參皂苷Rg3組合物膠囊劑對小鼠運動後血乳酸水平的影響
表6、7顯示，低、中、高三個劑量組小鼠運動後血乳酸升幅和降幅與陰性對照組比較差異均無顯著性（P＞0.05）。
組別 | 動物數（只） | 乳酸含量（毫摩爾/升） | P值* | ||
運動前（A） | 運動後0分鐘（B） | 差值（B-A） | |||
陰性對照 | 10 | 2.70±1.50 | 5.25±1.22 | 2.56±1.90 | |
低 | 13 | 3.23±1.20 | 5.68±1.42 | 2.45±1.57 | ＞0.05 |
中 | 14 | 2.90±1.01 | 5.15±1.14 | 2.25±1.12 | ＞0.05 |
高 | 13 | 2.91±0.82 | 5.60±1.43 | 2.69±1.49 | ＞0.05 |
差值（B-A）與陰性對照組比較
組別 | 動物數（只） | 乳酸含量（毫摩爾/升） | P值* | ||
運動後（B） | 運動後0分鐘（C） | 差值（B-C） | |||
陰性對照 | 10 | 5.25±1.22 | 1.58±0.47 | 3.68±0.91 | |
低 | 13 | 5.68±1.42 | 1.83±0.97 | 3.85±1.24 | ＞0.05 |
中 | 14 | 5.15±1.14 | 1.92±0.43 | 3.23±1.14＞0.05 | |
高 | 13 | 5.60±1.43 | 1.78±0.61 | 3.82±1.31 | ＞0.05 |
差值（B-C）與陰性對照組比較
1.3小結
20（R）人參皂苷Rg3組合物膠囊劑抗疲勞試驗結果顯示，低、高劑量組小鼠負重遊泳時間和低、中劑量組小鼠爬桿時間均顯著長於陰性對照組（P＜0.05），高劑量組小鼠運動後肝糖原含量明顯高於陰性對照組（P＜0.05），中、高劑量組小鼠運動後血清尿素氮含量明顯低於陰性對照組（P＜0.05），運動後乳酸升幅和降幅與陰性對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。按評價標準認為本檢品（20（R）人參皂苷Rg3組合物膠囊）具有抗疲勞作用。
- 實施例49 20（R）-人參皂苷Rg3組合物膠囊劑改善記憶試驗
1.材料與方法
1.1材料
藥品：樣品20（R）人參皂苷Rg3組合物顆粒（10毫克/袋），由富力博士提供。東莨菪鹼購自中國藥品生物製品檢定所。憶恆顆粒（10克/袋），陝西開元製藥有限公司生產。上述藥品使用時均用生理鹽水配成所需濃度。
動物：昆明種小鼠，雄性18～22克，由吉林大學藥學院提供。
儀器：小鼠跳台儀、水迷宮裝置由吉林大學藥學院自製，接觸調壓器，中川集團公司上海振華穩壓器廠製造。
1.2方法
1.2.1跳台法
實驗開始前將動物置於實驗室適應環境1小時。實驗開始時，將動物放在跳台裝置放在跳台裝置的安全台上，適應環境3分鐘，然後同以36伏特電流，動物跳至銅柵時即遭受電擊，為錯誤反應，其正確反應是跳回安全區，如此訓練5分鐘。24小時後進行測驗。測驗時將跳台裝置同以36伏特電流，然後將動物放在安全台上，記錄3分鐘內的錯誤次數。
實驗步驟：選健康合格小鼠72隻，稱重，隨機分為6組，每組12隻。20（R）人參皂苷Rg3組合物顆粒劑量組分為2.16、6.48、12.96毫克/千克，陽性對照憶恆顆粒121.65毫克/千克，空白對照組和模型組給予生理鹽水0.1毫升/10克，每天1次，連續給藥7天，於末次給藥後1小時，空白對照組腹腔注射等容量生理鹽水，模型組、Rg3組合物顆粒實驗組、憶恆顆粒陽性對照組分別腹腔注射東莨菪鹼4毫克/千克，10分鐘後進行跳台訓練，24小時後測驗。
1.2.2小鼠迷路法
小鼠迷路裝置內設起步區、多盲端曲折迴路和安全區（一個台階）。每天給藥1小時後將小鼠放回起步區，誘導其游向安全區，每鼠每天訓練10次，每次間隔25秒，以30秒內到達安全區為正確反應，連續訓練4天。記錄各組動物正確反應次數，計算正確反應百分率及到達安全區的平均時間。
實驗步驟：實驗步驟：選健康合格小鼠72隻，稱重，隨機分為6組，每組12隻。20（R）人參皂苷Rg3組合物顆粒劑量組分為2.16、6.48、12.96毫克/千克，陽性對照憶恆顆粒121.65毫克/千克，空白對照組和模型組給予生理鹽水0.1毫升/10克，每天1次，連續給藥10天。在第7天給藥後1小時，於末次給藥後1小時，空白對照組腹腔注射等容量生理鹽水，模型組、Rg3組合物顆粒實驗組、憶恆顆粒陽性對照組分別腹腔注射東莨菪鹼4毫克/千克，10分鐘後進行水迷路訓練，每天每鼠訓練10次，每次間隔25秒，以30秒內到達安全區為正確反應，記錄各組動物正確反應次數，計算正確反應百分率。
2.結果
2.1對東莨菪鹼所致記憶獲得障礙的改善作用（跳台法）
結果如下表1所示，模型組與空白對照組相比，錯誤反應次數數顯著增多，表明4毫克/千克東莨菪鹼已造成記憶獲得障礙，模型成立；20（R）人參皂苷Rg3組合物顆粒實驗組與模型組相比，明顯減少了小鼠測驗期的錯誤次數降低，其作用效果明顯優於憶恆顆粒陽性對照組。實驗結果證明，20（R）人參皂苷Rg3組合物顆粒對小鼠記憶獲得障礙有明顯改善作用，可增強小鼠的學習記憶。
表1 Rg3組合物顆粒對東莨菪鹼所致小鼠記憶獲得障礙的改善作用（n＝12X±S）
組別 | 劑量（毫克/千克） | n | 錯誤反應次數 |
正常對照組 | 12 | 0.37±0.22** | |
東莨菪鹼模型對照組 | 12 | 3.8±2.35 | |
憶恆顆粒對照組 | 121.65 | 12 | 0.96±0.73* |
Rg3組合物顆粒 | 2.16 | 12 | 0.88±0.69* |
6.48 | 12 | 0.70±0.36* | |
12.96 | 12 | 0.44±0.23** |
2.2對東莨菪鹼所致空間辨別障礙的改善作用（水迷路法）
結果如表4所示。模型組小鼠正確反應率較正常對照組顯著降低，20（R）人參皂苷Rg3組合物顆粒從訓練第2天開始，劑量依賴性地提高小鼠正確反應百分率，對東莨菪鹼所致小鼠空間辨別障礙具有顯著改善作用。
表2 Rg3組合物顆粒對東莨菪鹼所致小鼠空間辨別障礙的改善作用（n＝12X±S）
組別 | 劑量（毫克/千克） | n | 第2天 | 第3天 | 第4天 |
正常對照組 | 12 | 33.11±24.10 | 42.23±22.14 | 52.08±31.31 | |
東莨菪鹼模型對照組 | 12 | 8.75±7.21 | 13.45±8.74 | 26.582±6.52 | |
憶恆顆粒對照組 | 121.65 | 12 | 10.88±6.64 | 17.95±17.23 | 27.96±26.47 |
Rg3組合物顆粒 | 2.16 | 12 | 10.98±5.12 | 25.87±14.52 | 52.71+29.46 |
6.48 | 12 | 19.25±15.34 | 35.26±15.49 | 55.789±23.56 | |
12.96 | 12 | 27.98±17.68 | 59.80±26.41 | 61.58±34.64 |
- 實施例50 20（R）-人參皂苷Rg3組合物消腫止痛癒合傷口試驗
1.材料與方法
1.1實驗動物：30隻大鼠（吉林大學藥學院實驗動物中心提供），體重250-300克，雌雄各半，隨機分三組。
1.2方法
1.2.1生物學評價動物創傷制模：用8％硫酸鋇脫掉大鼠後肢的毛，無皮膚破損，24小時後用3％戊巴比妥鈉30毫克/千克腹腔內麻醉，俯臥位固定於造模裝置板上，讓後將質量為1千克的打擊錘牽拉至10厘米出，突然垂直落下鐵錘，打擊大鼠後肢股部肌肉最豐滿處，即造成急性軟組織損傷模型。致傷30分鐘後，用手術刀切開皮膚1.5-3.0厘米深至肌層，並取出0.5克肌組織。傷口根據分組作相應的處理。實驗組貼20（R）人參皂苷Rg3組合（1克溶於1毫升生理鹽水中），陽性對照組塗雲南白藥（1克白藥溶於1毫升生理鹽水中），陰性對照組塗生理鹽水，1次/天。
1.2.2監測指標：將受試的大鼠根據分組分籠餵養，創傷後清醒0.5小時，隔10分鐘用一次性塑膠棒輕碰大鼠的雙後肢創面，觀察2小時（刺激12次）內大鼠舔創面、縮肢反應，站立時後肢肌肉抖動等疼痛行為反應，拍攝3天、7天傷口癒合大體情況，記錄創面感染率。7天后將動物處死評估各組動物的體重變化。
1.2.3統計學分析：採用SPSS10.0統計軟體進行統計分析，計數資料採用X檢驗，計量資料採用方差分析，p＜0.05為差異具有顯著性。
2結果
2.1實驗後不同組別大鼠清醒後2小時的疼痛行為反應情況
見下表1。在舔面、縮肢反應站立時後肢肌肉的抖動等疼痛行為反應，三組結果方差分析總體比較有顯著差異（p＜0.01）；均數經過兩兩比較，人參皂苷Rg3組合物組分別與雲南白藥、生理鹽水組在舔面方面有顯著差異（p＜0.05）；在縮肢反應、肌肉抖動方面無明顯差異（p＞0.05）。上述結果表明，人參皂苷Rg3組合物組具有鎮痛作用，且優於雲南白藥組。
2.2大鼠雙後肢創傷後不同組織傷口的感染情況
見下表2。三組感染率經過X檢驗比較有顯著差異（p＜0.01），說明人參皂苷Rg3組合物組具有抗感染作用，其對大鼠傷口的感染率明顯低於雲南白藥及生理鹽水對照組。
2.3不同組別大鼠傷口修復的大體情況
肉眼觀察傷口結果，傷後3天人參皂苷Rg3組合物組傷口乾燥、無滲液，創緣皮膚收縮明顯；雲南白藥組傷口有少量分泌物，創緣輕度收縮；生理鹽水組傷口大量分泌物，創面面積增大，創緣有膿痂。傷後7天天人參皂苷Rg3組合物，組傷口乾燥、無感染，傷口基本被肉芽所充填，明顯的新生上皮增長；雲南白藥組傷口面積縮小，少量滲出，僅見薄層肉芽，未見明顯的新生上皮增長；生理鹽水組傷口膿8滲出較多，傷口面無明顯縮小，且形成潰瘍面。上述結果表明，天人參皂苷Rg3組合物組在消腫收斂、抑菌和縮短創面癒合的作用明顯優於雲南白藥及生理鹽水對照組。
組數 | 例數 | 舔創面 | 所肢反應 | 抖動 |
生理對照組 | 10 | 1.30±1.50 | 0.70±1.11 | 5.30±3.16 |
雲南白藥組 | 10 | 9.00±2.16 | 9.40±2.59 | 10.70±1.33 |
Rg3組合物顆粒 | 10 | 11.20±0.92 | 11.40±0.84 | 10.40±1.43 |
*與其他兩組比較p＜0.01
組別 | 感染傷口數 | 未感染傷口數 | 合計 |
生理對照組 | 1 | 19 | 20 |
雲南白藥組 | 17 | 3 | 20 |
Rg3組合物顆粒 | 8 | 12 | 20 |
*p＜0.01
榮譽表彰
2016年12月7日，《20（R）－人參皂苷Rg3藥用組合物水溶液及製備方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
