魚類傳染性造血器官壞死病

魚類傳染性造血器官壞死病（Infectious Hemat-opoietic Necrosis，簡稱IHN）是由傳染性造血器官壞死病毒（ Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，簡稱IHNV）引起、發生在魚身上的一種常見病害。病魚眼球突出且變黑，腹部膨脹，肛門處拖著不透明或棕褐色的假管型黏液糞便

魚類傳染性造血器官壞死病常主要危害鮭鱒魚類的魚苗及當年幼魚，在2~3周內的死亡率可接近100%，致死率隨著魚的種類、大小、病毒的種類以及環境條件的不同發生變化。國際獸疫局（OIE）將此病列為必須申報的疾病，是魚類口岸第Ⅰ類檢疫對象，是中國二類疫病。

預防該傳染病最有效的方式是防止接觸病毒，使用無病毒的養殖水體，使用無病毒的魚卵，對患有IHN的養殖場的養殖廢水應經消毒後再排放進而限制病毒的擴散。

基本介紹

• 中文名：魚類傳染性造血器官壞死病
• 外文名：Infectious Hemat-opoietic Necrosis
• 別名：大鱗大馬哈魚病毒病
• 危害物種：鮭鱒魚類
• 病原：傳染性造血器官壞死病毒
• 侵害部位：腎造血組織

病害學史

魚類傳染性造血器官壞死病於1987年在歐洲的法國和義大利首次被發現。

隨後於1992年在德國被發現，病毒來源和傳入途徑不明。

病原特徵

傳染性造血器官壞死病毒呈典型的彈狀，大小為（120~300）納米×（60~100）納米，有囊膜，不耐熱、不耐酸，對甘油、乙醚、游離碘及氯仿敏感，在50%甘油中保存1~2周即失去活力。生長溫度為4~20℃，最適溫度為15~25℃時病毒不複製。IHNV的複製周期將IHNV在CHSE-214細胞株於18℃進行培養，4小時內產生新病毒直到16小時內為指數生長期，病毒滴度最高可達10pfu/mL細胞在感染10~15小時後病變明顯，表現為細胞核內染色質趨向邊緣，感染病毒的細胞漿內出現空泡，空泡邊緣處細胞堆積成葡萄狀，然後崩解。

在透射電子顯微鏡下觀察的傳染性造血壞死病毒

為害症狀

魚類傳染性造血器官壞死病典型體表狀為厭食嗜睡、異常遊動、眼突出、體色發黑、腹部積水，鰭條基部和肛門周圍充血，肛門外有白色不透明糞便，有些感染該病毒後存活的魚脊柱變形。解剖病魚可見肝臟、脾臟、腎臟、腸道等充血，並有卡他性炎症，體腔內有積水，鰓及內臟顏色變淡；口腔、骨骼肌、脂肪組織、腹膜、腦膜、鰾和心包膜常有出血斑點，腸出血，魚苗的卵黃囊也會出血、因充滿漿液而膨大，腸道內常常沒有食物。顯微鏡檢結果表明，腎臟、造血組織、胰臟、腸道和腎上腺皮質出現退化和壞死：胃腸固有膜的顆粒細胞、部分胰腺及胰島細胞也會發生變性和壞死。

感染IHNV魚觀察到的臨床症狀

圖：病魚（Ⅰ）觀察到擴張的內臟腔、在鰭和腹部的點狀出血和眼球突出。對照未感染的魚（C）沒有表現出任何臨床症狀。

流行情況

在種期患過魚類傳染性造血器官壞死病殘留的帶病毒魚是主要傳染源，病毒可隨著類、尿、性腺產物排入水中；病毒放到水中或拌在飼料中投餵均可引起發病說明病毒已通過鰓和消化道侵入魚體。魚類傳染性造血器官壞死病一般通過水平傳播感染宿主，然而垂直傳播或通過魚卵傳播也曾有報導。水平傳播一般是因直接與病毒接觸引起，但是在很多情況下低等無脊椎動物被認為起到中間體作用。經魚卵傳播者可以通過碘液消毒魚卵表面避免，但是1個地區不出現魚類傳染性造血器官壞死病的唯一方法是使卵在沒有這種病毒的水中孵化和孵育。

診斷方法

臨床診斷

對病魚進行解剖可觀察到肝臟、脾臟、腎臟、腸道等充血，鰓及內臟顏色變淡，腹腔內積有血樣液體，胃內有乳白色液體，腸內充盈黃色液體。垂死魚特徵性壞死發生於前腎和脾，在骨骼肌上也可看到病灶性出血，病灶樣壞死存在於肝和胰腺組織，腸黏膜下層則有嗜酸性粒細胞侵潤。垂死的魚腎竇充血，最終腎臟衰竭而致死。顯微鏡檢結果表明，腎臟、造血組織、胰臟、腸道和腎上腺皮質出現退化和壞死。常見病理變化是在腎臟中存在壞死的造血細胞，並引起肝、脾組織的細胞堵塞，而在某些胰腺組織中可看到變性和出血。不同魚類之間的病理變化差異明顯，情況複雜，因此臨床和病理診斷只能初步判斷，確診需要進一步的實驗室檢測。

病毒分離鑑定

細胞培養研究魚類病毒可以減少隱性感染幾率和個體差異引起的誤差，使試驗結果更加準確。利用合適的魚類細胞系分離增殖病毒，再通過抗體中和試驗確認有無病毒是檢測IHNV的典型方法。目前有多株細胞系可用於該病毒分離，常用的有RTG-2、EPC、CHSE、FHM等，IHNV能在這些細胞系中生長，並引起特徵性的細胞病變（CPE）。傳統的血清中和實驗對於滴度較低的病毒感染很靈敏但比較費時費力，通常在病毒感染很嚴重後才能出現陽性結果，不能滿足快速檢測的需要。

血清學診斷

瓊脂擴散試驗（AGP）

可溶性抗原與相應抗體在半固體瓊脂凝膠內擴散，二者相遇，在比例合適處形成白色沉澱。有單向瓊脂擴散試驗和雙向瓊脂擴散試驗兩種。瓊擴試驗操作簡單，不需特殊儀器，費用低。但由於特異性和敏感性差，現在的診斷已很少採用。

螢光抗體試驗（FAT）

螢光抗體檢測傳染性造血器官壞死病毒是一種靈敏性高、特異性好的診斷方法，而且操作簡單。冰凍組織切片或觸片的直接螢光抗體試驗被許多國家和地區作為法定的病毒診斷方法。Lapatra等4採用了螢光抗體試驗檢測INV病毒，對不同地區不同年齡段的大馬哈魚進行了試驗，認為其敏感性和特異性均非常好，且能在較短的時間內得到準確的診斷結果。

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

常用的ELISA測定方法主要有3類：雙抗體夾心法、間接法和競爭法測定抗原。早在1984年就報導了用直接法測定細胞培養的IHNV可在2小時內獲得結果。套用雙抗體夾心間接法對四種H進行了檢測，該方法對任何類型的HV檢測均有效，整個試驗可在1天內得到結果。趙志壯等建立了雙抗體夾心間接法，此方法的測定步驟中增加了BALB/C鼠抗血清做第二抗體，雖測定時間比直接法稍長，但酶標抗體可直接購買，免去了製備和鑑定標抗的複雜過程，在得到高效價的抗血清後，可對IHNV提供快速準確的診斷。

分子生物診斷

隨著科學技術的發展，分子生物學技術在診斷魚病方面的作用越來越大，並顯示出強大的生命力，成為在診斷方法上最準確最可靠的方法，同時也是最有發展前景的診斷技術。

普通反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術

目前，套用RT-PCR檢測水產動物病毒的技術已經非常成熟，許多實驗室都將該方法作為病毒檢測的主要手段。根據IHNV的N蛋白基因設計一對引物，建立RT-PCR檢測方法，該方法可對在福馬林浸泡保存2年的組織樣品進行準確檢測。根據病毒性出血敗血症病毒（Viral Haemorrhagic Septicemia Virus，簡稱VHSV）和IHNV的G蛋白基因分別設計一對引物，對RIG-2細胞分離培養的兩種純病毒進行RT-PCR檢測。該方法具有高度的特異性和敏感性，可在8小時內對VHSV和IHNV進行鑑別診斷。

其它反轉錄聚合酶鏈式反應技術

巢式PCR（Nested PCR）通過兩輪PCR反應使用兩套引物擴增特異性的DNA片斷。第二對引物的功能是特異性的擴增位於首輪PCR產物內的一段DNA片斷。第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在內引物的存在下進行第二輪擴增，從而提高反應的特異性。根據IHNV的G蛋白基因設計了兩對引物，對高滴度感染IPNV的細胞中的少量IHNV也能檢測出來。試驗證明該方法可檢出比IPNV滴度低1000倍的IHNV混合病毒液，因此該方法更加適合檢測有IPNV干擾的樣品。

螢光定量PCR技術

以其靈敏度高、特異性好，快速、準確等優點，在病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛套用。岳志芹等選取IHNV的N蛋白基因保守序列，利用軟體設計一對特異性引物和探針，建立了實時定量RT-PCR檢測法。該方法檢測靈敏度高，特異性試驗中與解春血症病毒（SVCV）、病毒性出血性敗血症病毒（VHSV）、傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）、草魚呼腸孤病毒（GCRV）、流行性造血器官壞死病毒（EHNV）、EPC細胞系、牙鮃的核酸均無反應，特異性強，且可以進行定量分析，在魚病的快速檢測上具有重要意義。建立多重螢光定量RT-PCR根據SVCV、IHNV和VHSV區別較大的基因序列設計了三對引物，能特異性地檢測出這三種病毒並進行區分，對PFRV、IPBV以及GCRV的檢測均為陰性，這種檢測手段司時適應於診斷和研究。

環介導等溫擴增技術（LAMP）

PCR方法雖然靈敏度高、特異性好，是目前最精準的基因診斷方法，但是操作相對複雜，對儀器和人員要求較高，不適合基層或現場快速診斷。2000年日本學者Notomi公布了“環介導等溫擴增反應”（Loop-mediated Isothermal Amplifi-cation，簡稱LAMB）檢測技術。該方法不僅特異性高，而且比PCR、Real-time PCR檢測時間更短，1小時內在恆溫條件下完成反應，對儀器的要求也不高，簡便快捷，適合基層快速診斷，是一種非常有發展潛力的分子生物學診斷方法。Gunimaladevi等建立了診斷虹鱒魚類傳染性造血器官壞死病的RT-LAMP檢測法。根據IHNV的G蛋白基因，設計了兩對外引物和兩對內引物，在63℃條件下反應1個小時即可得到結果，實驗結果證明該方法比傳統的巢式PCR的靈敏度高10倍。

其它分子生物學診斷手段

Gonzalez等套用一種由生物素和鹼性磷酸酶標記的探針對IHNV的病毒RNA進行斑點雜交檢測。該方法可檢測到4pg的RNA，除了操作簡單之外還能在6小時內得到診斷結果。劉斌等採用原位雜交技術對組織切片中不同細胞，不同部位靶基因進行精確定位，檢測IHNV結果表明該方法特異性強、靈敏度高，是一種很好的水生動物動物病毒定位檢測方法。吳斌等利用IHNV的核蛋白基因，通過巢式PCR擴增出一條323bp的片段，DIG標記為探針，建立了測定IHNV在病魚體各組織中分布情況的原位雜交方法。原位雜交技術能確定IHNV在病魚體內不同組織的分布情況。

防治措施

魚類傳染性造血器官壞死病一旦爆發，會給養殖漁業帶來巨大的經濟損失，做好防治工作十分必要。對於IHNV，目前還沒有特效的預防藥物，製備高效的疫苗是預防IHNV的有效措施。其首要任務就是提高疫苗的安全性以及公眾對疫苗潛力的廣泛認可，更多的與基礎風險相關研究能讓人們更好地了解引進DNA疫苗對水產養殖的影響。考慮到安全性的同時，接種方式也是DNA疫苗在當今商業養殖市場能否套用的重要決定因素雖然注射免疫被認為是魚體疫苗接種最有效的方法，然而考慮到小魚種以及低價值魚種，肌肉注射不實際或成本高口服或浸泡免疫方式是很有前景的2種免疫接種方法。此外，目前人們對魚體針對IHNV的免疫相關基因已有一定研究IHNV與宿主免疫系統的相互作用機制的深人研究能為IHNV的防治提供新的策略。

抗病育種

選育新的鮮魚品種來降低養殖魚類對IHNV的敏感性是控制IHN爆發的有效方法之一。一方面可以從自然環境中選育對IHNV敏感度小的鮮魚品種，同時也可以利用生物技術選育對IHNV不敏感的二倍體或多倍體魚品種Lapatraetal建立了一個模型系統檢測種間雜交對病毒的免疫機制，研究發現使用熱誘導雌性褐鱒與雄性湖雜交形成的三倍體，經暴露感染後累計死亡率為2%，顯著低於二倍體虹鱒（53%），並且抗體滴度顯著高於二倍體虹。三倍體對IHNV的防禦主要發生在細胞水平上即減少感染，同時將病毒細胞內化。

疫苗

對健康的魚體進行早期免疫接種是預防病毒病的常用方法。疫苗接種可以刺激魚類免疫系統產生特異性免疫反應，增強魚體抗病力，從而降低疾病的發生率。為了控制已研製出3種類型的疫苗即滅活疫苗、減毒疫苗以及重組疫苗，其中後者包括DNA疫苗N、G蛋白亞單位疫苗和合成肽疫苗。

其他措施

• 1.消毒水：在孵化和苗種培育車間進水口處安裝紫外線消毒儀或臭氧發生儀，對車間用水進行消毒。
• 2.消毒用具：孵化生產前，車間內全部容器、工具消毒後備用。
• 3.消毒受精卵：受精卵使用聚維酮碘消毒。
• 4.孵化管理：孵化過程中，及時收集卵殼。
• 5.對孵化車間實行封閉式管理，對外來人、工具等嚴格控制。
• 6.發現魚有異常跡象，隨時撈出處理掉，處理地點遠離養殖用水。