《高效低免疫原性黃精凝集素分子設計與驗證》是依託四川大學，由鮑錦庫擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：高效低免疫原性黃精凝集素分子設計與驗證
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：鮑錦庫
- 依託單位：四川大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
黃精凝集素具有特異抗HIV等病毒和抑制腫瘤細胞增殖活性以及很低的毒副作用，顯示出良好的成藥性；鑒於外源藥用蛋白可能的免疫原性，進入體內易產生中和性抗體而影響療效，甚至產生耐藥性問題。本申請課題針對黃精凝集素未來體內套用可能面臨的免疫原性等問題及耐藥性問題，在前期研究基礎上結合其高解析度晶體學結構數據，擬綜合運用結構生物信息學方法和蛋白質工程等技術手段，通過分析具有我國人群代表性的T細胞系列候選表位多肽，篩選黃精凝集素中與我國人群相關的優勢T細胞抗原表位及關鍵胺基酸殘基，進一步通過定點突變技術改造黃精凝集素分子中的細胞抗原表位。重組表達、純化組合突變體，通過抗體結合分析及細胞和動物體內實驗，確認黃精凝集素免疫原性的降低（或去除）和抗腫瘤抗病毒活性的保留(或變化)，在保持活性的基礎上減低(或消除)其免疫原性，為最終創製新一代具自主智慧財產權、低(或無)免疫原性的創新藥物及其未來可能的套用打下基礎
結題摘要
黃精凝集素（Polygonatum cyrtonema Hua. lectin，PCL）是低毒高效的具有抑制腫瘤細胞增殖活性、抗HIV等病毒活性的甘露糖特異結合蛋白，顯示出良好的成藥性。但作為外源蛋白，其進入體內易產生中和性抗體而影響療效，甚至產生耐藥性。為在不影響其生物學活性的基礎上降低其免疫原性，本研究結合黃精凝集素高解析度晶體學結構數據，運用結構生物信息學方法、生物化學和分子生物學技術手段，通過分析在黃精凝集素的胺基酸序列中與免疫相關的T細胞和B細胞抗原表位，篩選出了黃精凝集素胺基酸序列中與我國人群相關的5條T細胞抗原表位多肽和2條B細胞抗原表位多肽，根據生物信息的分子對接方法進行打分計算，選擇4個關鍵胺基酸殘基（V18，G19，P20，P100），利用定點突變技術將其分別突變為 C18，Q19，H20，S20，R100，從而改造黃精凝集素分子中的細胞抗原表位。首先分別設計5個單一突變位點， mrPCL1-V18C，mrPCL2-G19Q，mrPCL3-P20H，mrPCL4-P20S，mrPCL5-P100R。採用原核表達系統對野生型PCL及所有突變體進行重組表達與純化，獲得野生型及突變黃精凝集素。黃精凝集素第二、第三結合位點的回覆突變表明凝集素甘露糖結合能力升高，其抗腫瘤細胞增殖活性也隨之增強。 通過活性實驗及細胞實驗，對比突變蛋白，確認第一個突變體(mrPCL1)和第二個突變體(mrPCL2)相比野生型黃精凝集素的凝集活性及抑制腫瘤細胞活性有所下降，但理化性質穩定，其中，第二個突變體(mrPCL2)相比第一個突變體(mrPCL1)體外抑制腫瘤細胞活性更強。將製備的多克隆抗體用於檢測不同類型PCL突變蛋白，野生型和突變型黃精凝集素的Western blot 檢測和ELISA檢測顯示， 野生型和突變體均能結合抗體，但ELISA檢測發現，突變體與抗體的結合能力顯著下降。 鑒於第二個突變體(mrPCL2)體外抑制腫瘤細胞活性更強以及其與抗體結合能力下降，在此基礎上，將第二個單一位點突變作為組合突變的位點首選，再結合與糖結合活性和抑制腫瘤細胞增殖活性相關的位點進行組合突變。結合上述研究結果，進行了黃精凝集素糖結合位點的回覆突變與第二個突變體(mrPCL2)的組合突變，抗體結合及腫瘤細胞增殖實驗發現組合突變體的抗體結合能力大幅下降，但其體外抑制腫瘤細胞增殖活性增
