《骨鈣素誘導椎體軟骨終板退變鈣化的作用機制研究》是依託同濟大學，由王善金擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：骨鈣素誘導椎體軟骨終板退變鈣化的作用機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：王善金
- 依託單位：同濟大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
骨鈣素（OCN）主要是成骨細胞分泌的蛋白，研究表明OCN能調控糖脂代謝並能誘導鈣化。我們前期工作證實軟骨終板細胞在培養過程中有OCN分泌，且OCN能促進軟骨細胞鈣化，OCN的表達與軟骨內骨化過程相關，提示OCN對軟骨細胞代謝有重要影響。我們認為OCN參與誘導椎間盤軟骨終板退變鈣化，但其機制尚不明確。本課題擬採用大鼠軟骨終板退變模型，從組織學、細胞學、分子生物學水平上觀察OCN表達與軟骨終板凋亡鈣化相關指標的關係；觀察外源性OCN及細胞內OCN過表達對體外培養的軟骨終板細胞代謝的影響，並分析可能參與的下游信號傳導途徑（Wnt，BMP等）；然後通過RNA干擾技術抑制OCN的表達，深入探討OCN對體內和體外培養的軟骨終板細胞凋亡和鈣化的影響，系統分析OCN在椎間盤軟骨終板退變中的調控機制，為最終闡明椎間盤退變病理機制奠定堅實的理論基礎和實驗依據, 為椎間盤退變相關疾病的防治開闢新思路與新途徑。
結題摘要
骨鈣素（OCN）主要是成骨細胞分泌的蛋白，研究表明OCN 能調控糖脂代謝並能誘導鈣化。我們前期工作證實軟骨終板細胞在培養過程中有OCN 分泌，且OCN 能促進軟骨細胞鈣化，OCN 的表達與軟骨內骨化過程相關，提示OCN 對軟骨細胞代謝有重要影響。本課題的主要研究內容、重要結果和關鍵數據包括：①套用小鼠內胚竇瘤細胞誘導構建軟骨終板細胞模型，套用外源性瘦素刺激所誘導的軟骨細胞，套用RT-PCR技術以及Western-Blot技術首次揭示證明瘦素可顯著提高軟骨細胞內骨鈣素的表達，並受時間梯度以及濃度梯度影響；並證實骨鈣素的表達與ERK通路磷酸化上調有關。②構建由應力失衡誘導的SD大鼠軟骨終板退變模型, 通過X線以及H&E、阿利新藍染色觀察所建大鼠模型椎間盤的退變情況。套用Western-Blot以及組織免疫螢光技術檢測在終板退變大鼠以及正常大鼠軟骨終板中瘦素、骨鈣素的表達變化。③提取大鼠軟骨終板原代細胞，套用外源性重組大鼠瘦素刺激軟骨細胞，發現外源性重組大鼠瘦素可以顯著增加骨鈣素在mRNA以及蛋白水平上的表達，並呈時間及劑量依賴關係，瘦素刺激大鼠軟骨細胞7天后，經茜素紅以及馮庫薩染色，發現大鼠軟骨細胞增值鈣化作用明顯。④分析瘦素誘導大鼠軟骨終板細胞骨鈣素表達的信號傳導途徑，用Western-blot檢測NF-kB p-65磷酸化的時間效應。P-p-65在5分鐘時開始增強,15-30分鐘時磷酸化逐漸加強,至60分鐘時恢復至基礎水平。統計分析顯示15分鐘時磷酸化增加了4倍(P＜0.05)。對大鼠軟骨細胞轉染NF-kB p-65小干擾RNA，將磷酸化的P-65沉默，再用瘦素刺激軟骨細胞，發現骨鈣素較對照組表達減少。⑤進一步探討瘦素誘導骨鈣素OCN表達增高與NF-kB信號通路之間的關係，在基因水平上檢測OCN與NF-kB的關係。首先用基因軟體預測OCN啟動子與NF-kB的結合位點，5,RACE驗證OCN的啟動位點，套用雙螢光素酶進一步驗證OCN啟動子與NF-kB的結合位點。免疫共沉澱檢測內源性NF-kB與OCN的結合情況。本課題深入探討OCN 對體內和體外培養的軟骨終板細胞凋亡和鈣化的影響，系統分析OCN 在椎間盤軟骨終板退變中的調控機制，為最終闡明椎間盤退變病理機制奠定堅實的理論基礎和實驗依據, 為椎間盤退變相關疾病的防治開闢新思路與新途徑。
