騰衝熱海棲熱菌噬菌體TSPcpn47蛋白的分子伴侶特徵研究

《騰衝熱海棲熱菌噬菌體TSPcpn47蛋白的分子伴侶特徵研究》是依託昆明理工大學，由林連兵擔任項目負責人的地區科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：騰衝熱海棲熱菌噬菌體TSPcpn47蛋白的分子伴侶特徵研究
• 項目類別：地區科學基金項目
• 項目負責人：林連兵
• 依託單位：昆明理工大學

項目摘要

高溫噬菌體因其獨特的基因組成和進化特徵，使其倍受關注。在前期研究中，項目組完成了棲熱菌噬菌體TSP4的基因組解析，並推測TSP4基因組上的ORF47可能表達為與原核生物ClpB相似的分子伴侶蛋白，命名此蛋白為TSPcpn47。初步實驗表明，TSPcpn47具備一定的分子伴侶基本特徵。鑒於分子伴侶在生命活動中的重要意義，且在高溫噬菌體（病毒）中，未見病毒分子伴侶研究的相關報導，本研究擬通過ATP結合位點突變分析、變性蛋白與復性分析、表面等離子共振分析等方法，研究TSPcpn47的ATP水解活性、防止變形蛋白聚集以及促進變性蛋白復性、與變性蛋白結合能力等特徵，並通過其對Tsp4噬菌體功能蛋白熱穩定性影響研究，進一步探討TSPcpn47的分子伴侶功能。.項目研究將有助於發現新的分子伴侶類型及其功能，對其在提高蛋白質熱穩定性的作用和功能研究，對探索高溫噬菌體在高溫環境下的適應性機制也有其特殊意義。

結題摘要

分子伴侶(molecular chaperones)是一類在進化上非常保守的蛋白質家族, 它能非特異性結合不同的蛋白質並催化介導這些蛋白質形成特定的構象, 在生物體內起著穩定新生蛋白、輔助其他蛋白質正確摺疊、組裝、轉運甚至降解的作用。 本研究的分子伴侶TSPcpn47蛋白來源於高溫菌噬菌體TSP4，對其進行了以下研究。 1.從生物信息學上分析TSPcpn47屬於AAA+家族，含有2個motif分別為walker A motif和Walker B motif；但與目前已研究的其它分子伴侶的同源性普遍較低。利用生物學軟體Editseq和RSCU算法統計噬菌體TSP4密碼子使用頻率並分析其偏嗜性，確定了E.coli Rosseta 菌株為TSPcpn47基因表達的適合宿主菌，並完成TSPcpn47的克隆表達和純化。 2.驗證了TSPcpn47蛋白具有ATPase活性，其在60℃下所測得的酶活力最高。具備ATP酶活性是分子伴侶的基本特徵。 3.驗證了TSPcpn47蛋白能形成聚合體，具備形成聚合體也是分子伴侶的基本特徵。但其聚合體的形成需要在一定的緩衝液、溫度和Mg2+濃度條件下才能形成。在pH7.8的300mM咪唑緩衝液中，20mM MgCl2，4mM ATP，TSPcpn47的濃度為0.08μg/μL，處理方法為先37℃溫育4h後4℃冷藏8h不變的條件下。 4.驗證了TSPcpn47蛋白具備和dUTPase蛋白結合形成複合物的能力。TSPcpn47蛋白和其它蛋白結合，是其發揮其分子伴侶功能的重要基礎。 5.驗證了TSPcpn47蛋白具備提高蛋白質熱穩定性的功能，添加TSPcpn47蛋白能顯著提高來源於噬菌體TSP4的裂解酶和dUTPase在高溫下的剩餘酶活力，對來源於常溫酶的膽鹼酯酶在高溫下的酶活力也有明顯的保護作用。 6.此外TSPcpn47蛋白不僅能夠幫助變性的GFP蛋白復性，使GFP恢復到原始螢光強度的65%以上，而且在60℃溫度處理1h以後，還能夠保存GFP蛋白50%以上的螢光強度，比對照組高出30%。 總之，分子伴侶在噬菌體中是非常罕見的，對TSPcpn47蛋白的研究不但有助於探索其耐熱機制，TSPcpn47對蛋白熱穩定性具有的保護作用也使其具有廣泛、潛在工業套用價值。