《食品級枯草桿菌Sec途徑高效分泌脂肪氧合酶的分子機制》是張充為項目負責人,南京農業大學為依託單位的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名:食品級枯草桿菌Sec途徑高效分泌脂肪氧合酶的分子機制
- 項目類別:青年科學基金項目
- 項目負責人:張充
- 依託單位:南京農業大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
建立安全、高效的重組生物製品表達系統具有重要的理論和套用價值。本課題組前期建立了一種基於賴氨酸營養缺陷的食品級枯草桿菌表達系統,通過Sec途徑首次實現了一種脂肪氧合酶的分泌表達,但分泌效率過低。而目前,Sec途徑高效分泌的分子機制還未闡明,推測分泌效率可能與分泌前體的加工效率有關。然而哪些因素影響Sec途徑脂肪氧合酶分泌前體的加工效率,國內外尚無報導。在前人有關該途徑研究基礎上,提出加工效率可能與下列因素有關:(1)信號肽酶與底物的特異性識別及信號肽酶表達量;(2)分子伴侶表達量;(3)分泌途徑裝置蛋白結構域。為證實假說,設計實驗逐一研究上述因素與分泌效率的關係。本項目針對食品級枯草桿菌分泌效率低的問題,通過研究影響前體加工效率的因素,揭示Sec途徑高效分泌的分子機制。研究結果有可能突破該途徑高效分泌外源蛋白的制約因素,為構建高效分泌表達脂肪氧合酶的食品級工程菌提供理論基礎和技術支撐。
結題摘要
國內外有關枯草桿菌分泌表達外源酶基因的研究較多,而有關該表達系統高效分泌表達的分子機制研究研究較少。本研究以來源於魚腥藻PCC7120的脂肪氧合酶基因(Ana-LOX)為靶基因,從宿主的食品級改造、表達載體的構建等方面研究影響分泌表達外源重組酶蛋白的影響因素,同時,研究了重組工程菌的產酶發酵條件,及重組酶在麵製品中的套用效果。從枯草桿菌168著手,針對其蛋白酶分泌能力強的缺陷問題,利用同源重組的方法構建獲得了一株賴氨酸營養缺陷型的菌株BS-PS,建立了一套無抗生素抗性標記的篩選突變菌株的方法,獲得了aprE和nprE兩個蛋白酶基因失活的菌株LD02,該菌株作為外源基因表達的宿主,達到食品級要求。研究發現分子伴侶、信號肽的組成和結構影響重組酶的分泌效率,構建的pHPSBR-ana-LOX工程菌胞外活性最高達到46 U/mL,分泌效率也最高為35﹪。利用自主建立的枯草桿菌無標記基因修飾技術,首次將T7噬菌體轉錄調控系統套用與枯草桿菌表達系統,成功實現了4種不同來源的酶基因在T7系統下得到有效轉錄,其中3個酶基因獲得了活性表達,研究結果為挖掘新型啟動子系統拓展了方向。採用Plackett-Burman設計法,建立了枯草芽孢桿菌產脂肪氧合酶的最佳工藝,酶活達到167.32U/ml。將重組Ana-LOX套用於麵條、麵包,結果表明重組酶對於麵製品具有較好的改良效果。