顯微鏡光度術 （microscope photometry）是為定量測定生物組織、細胞和細胞器中的化學成分，結合運用顯微鏡技術與光度術測量微小物體光強度的技術。它與一般光度術的區別是：顯微鏡光度術是測定像的光，而一般光度術是直接測定來自物體的光；與流式細胞術相比較，顯微鏡光度術測量速度慢，但能在定量測定物質成分的同時，確定它在組織或細胞中的位置。因此，顯微鏡光度術已成為一種靈敏的、多用途的顯微定量分析手段。
基本介紹
- 中文名：顯微鏡光度術
- 外文名：microscope photometry
- 作用：定量測定生物組織
- 運用：顯微鏡技術與光度術
概述,顯微鏡光度計,顯微鏡吸收光度術,顯微光密度術,顯微鏡螢光光度術,顯微鏡反射光度術,
概述
1936年，瑞典生物學家T·O·卡斯珀松最先設計和使用顯微鏡光度術測量細胞中核酸對紫外光的吸收，從而在細胞原位間接測定了核酸的含量。
顯微鏡光度計
顯微鏡光度術所用顯微鏡光度計是以顯微鏡為主體，加上光度測量系統（測量光闌、光電倍增管和單色儀等）和電學系統所組成。測量光闌位於樣品中間像平面上，用於限定測定範圍。根據特殊目的所設計的這類儀器，因部件不同，被命名為顯微光度計、顯微分光光度計、顯微光密度計、細胞螢光光度計、掃描顯微干涉儀等。根據光與物體相互作用的性質，顯微鏡光度術可分為吸收光度術、螢光光度術和反射光度術等。
顯微鏡吸收光度術
通過測定樣品的透光度測定樣品化學成分的技術。所用儀器的構造見圖。選擇單色光照明（一般選吸收峰值的波長），首先測量通過樣品周簡單的顯微鏡光度計圖解圍空白區的光強度I0，再測量通過樣品的光強度1，這樣就可以得到樣品的透光度（T）（T=I/I0）。進而推算出樣品的吸光率（E）〔E=log（1/T）〕。根據朗伯-貝爾定律，E=K·C·d，此處C為樣品濃度，K為克分子消光係數，d為樣品厚度。又因為C=m/d·B，所以m=B·E/K，此處m為樣品的質量，B為樣品的面積。所以通過測量透光度，再轉換為吸光率就可推算出樣品的化學成分。
分別用波長為260納米和280納米的紫外光照射，可測定細胞中的核酸和蛋白質的含量。用波長為400～700納米的可見光照明，可測定細胞中色素（葉綠素和血紅素）的含量。用與細胞中特殊成分結合的染料來染色，利用染料與細胞中成分呈化學計量關係，則可通過測定細胞中染料的透光度來測定細胞中某種成分的含量。表1列出常用的測定細胞內一些化學成分的染色反應。
由於細胞中成分分布不均勻，常造成吸收測量的分布誤差，可用一波長兩區域法、兩波長一區域法或掃描法校正這種誤差．掃描法可把測量面積減小到顯微鏡的分辨水平，在微小面積範圍中可視被測成分為近似均勻分布，對整個樣品進行全面積的逐點掃描後，把每個測點的化學成分加在一起，即可測得樣品總的化學成分和面積的數值。利用這種高分辨的掃描技術，結合一些形態學分析，可對某些酶的分布和活性進行定量研究，分析核型和染色體帶型。
顯微光密度術
用透射光測定底片的吸收率（也稱黑底）。適用於普通照相底片、顯微攝影底片，電鏡底片、X射線衍射底片、光譜線底片和放射自顯影底片等。樣品的吸收光譜採用固定測量區域，用單位儀的不同波長分別掃描樣品和空白區而測得。吸收光譜對於鑑別物質和掌握顯微鏡吸收測量條件都很有用處。
顯微鏡螢光光度術
測定材料在螢光顯微鏡下所產生螢光像的螢光強度的技術。由於螢光是由螢光物質直接產生，所以測量時沒有分布誤差、靈敏度高、且能利用不同的激發光測定一個樣品的多種螢光物質，因而可對同一個細胞的多種成分如 DNA、RNA和蛋白質進行相關測定。螢光強度的測定可用透射光或落射光照明，最常用的是利用落射光明場照明的螢光照明器。
在落射光照明時，螢光物質的濃度和螢光強度遵守以下公式：
F=I0Qrel（1－e-kCd）
式中F為螢光發射強度；I0為照明的落射光強度；Qrel為相對量子產額；K為螢光物質的克分子消光係數；C為螢光物質的濃度；d為螢光物質厚度。
只有在一定的條件下（落射光照明和螢光物質低濃度時），螢光發射強度和螢光物質濃度間是近似的線性關係。與吸收光度術不同，因受儀器因素的影響，顯微鏡螢光光度術所測的螢光強弱只是一個相對的數值。所以需要一種螢光標準（一般用鈾玻璃）來校正整個儀器狀態。還需要一種生物樣品作為內插標準（如淋巴細胞），它與所測定的樣品同時染色和測量，以便於不同製備條件下的樣品之間能互相比較。
利用顯微螢光光度計可以測定：細胞中螢光物質如脂褐素、葉綠素和血紅素的含量，免疫螢光的強度，神經遞質生物單胺的螢光強度。此外，通過測定酶作用後螢光底物所產生的螢光強度可以測定酶的含量和酶的動力學參數。利用特異的螢光染料（表2）和細胞的一定成分相結合，如果二者皇化學計量關係，則通過測量螢光染料的螢光強度，可以間接測得細胞成分的含量。
在物鏡和光電倍增管之間加上一個單色器，則可通過改變波長測定螢光發射光譜，用於鑑別組織和細胞中的螢光物質，還可用於研究細胞中的能量轉移現象。此外它也是掌握顯微螢光測量條件所必要的。
顯微螢光光度術的優點是在測量螢光強度的同時，還能確定螢光物質在組織及細胞中的部位。不足之處是測量時螢光容易消褪，還常有自發螢光和非特異性螢光的干擾，以至影響了測量的準確性。70年代以來用光多道分析儀測量細胞的螢光發射譜（僅用32msec），可彌補這些缺點。
顯微鏡反射光度術
通過測量顯微自顯影銀粒反射光的強度來測量銀粒密度的技術。顯微放射自顯影中銀粒的數目與其反射光的測定數值呈線性關係，並且銀粒數目與被標記的物質含量也呈線性關係，因此通過對銀粒反射光的測定可推算出被標記物質的量。這比計數銀粒快而且準確，當和顯微鏡螢光光度法同時利用時（如用螢光物質標記細胞內DNA），可以同時測出細胞中的銀粒和與銀粒重疊部位的螢光標記的物質含量（如細胞核內DNA）。要滿足以上測量條件，應使顯影的銀粒儘可能均勻，並且銀粒不要過密。測量銀粒反射光可用垂直暗場或垂直明場照明兩種方法。後者可以控制照明區域，在這種情況下可見到在暗背景中明亮的銀粒。
顯微鏡光度術還可用於測量不染色生物樣品的光程差，進而推算出物質的厚度和濃度（或質量）。
